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Title: Immunophenotypic, genetic and molecular characterization of B-cell chronic lymphoproliferative disorders: multiclonal versus monoclonal nature
Authors: Henriques, Ana Filipa Parreira Carvalheira dos Santos 
Orientador: Órfão, Alberto
Faro, Carlos
Keywords: B-cells; B-cell chronic lymphoproliferative disorders; monoclonal B-cell lymphocytosis; chronic lymphocytic leukemia; multiclonality; immunogenetics; cytogenetics; immunophenotyping
Issue Date: 9-Apr-2015
Citation: HENRIQUES, Ana Filipa Parreira Carvalheira dos Santos - Immunophenotypic, genetic and molecular characterization of B-cell chronic lymphoproliferative disorders : multiclonal versus monoclonal nature. Coimbra : [s.n.], 2015. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/26349
Abstract: Hoje o conhecimento dos mecanismos envolvidos na patogenia das doenças linfoproliferativas crónicas de célula-B (B-CLPD) assume uma importância crescente. De forma geral, a sobrevivência e/ou proliferação da célula tumoral depende tanto das anomalias genéticas das células neoplásicas como do microambiente tumoral. Neste sentido, o desenvolvimento generalizado de técnicas moleculares para a caracterização quer das alterações genéticas presentes nas células tumorais, quer das características do recetor das células B (BCR), mostrou-se fundamental. Como consequência, a leucemia linfocítica crónica (CLL) é hoje considerada como o protótipo para várias doenças de células B em que as interações com o microambiente, mais que a presença de uma anomalia genética específica, são cruciais no surgimento, expansão ou mesmo na progressão da doença, em pelo menos uma fração dos casos. Neste sentido, a existência de um repertório de genes da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina (IGHV) tendencioso juntamente com um estado mutacional particular e a recente identificação em casos não relacionados de locais de ligação ao antigénio (Ag) praticamente homólogos (BCR “estereotipados") é, regra geral, indicativo do envolvimento de um conjunto limitado de Ags, superantigénios ou ambos, no desenvolvimento da doença, fomentando a investigação das fases iniciais da mesma, p.e., através do estudo da linfocitose monoclonal de células B (MBL). Neste sentido, a citometria de fluxo veio facilitar a identificação de casos de MBL com (MBLhigh) ou sem (MBLlow) linfocitose B absoluta, a qual precede a maioria dos casos de CLL, permitindo assim a investigação de potenciais mecanismos envolvidos na transição de tais estados precursores tipo MBL, para CLL. Uma vez que a tumorigénese consiste num processo em várias etapas, os primeiros eventos transformantes podem ainda ocorrer em etapas mais precoces, quer diretamente na contrapartida normal da célula de CLL ou talvez, mesmo no compartimento de células estaminais hematopoiéticas de doentes com CLL. Para resolver esta questão, na presente tese de doutoramento investigámos múltiplas características fenotípicas e do BCR de células B clonais assim como do seu microambiente, numa série relativamente ampla de clones MBL, CLL/B-CLPD, tanto de casos monoclonais como multiclonais. De forma a explorar se determinados Ags poderão estar envolvidos em vias citogenéticas específicas durante as fases inicias do processo oncogénico, na primeira parte do estudo, focámos o nosso interesse na potencial associação entre determinados perfis citogenéticos e repertórios IGHV específicos. Num segundo passo, foram comparadas as características do BCR e as alterações citogenéticas dos clones de células B de casos monoclonais vs. casos multiclonais para determinar neste último grupo de doentes, a possível existência de uma maior homologia nos BCR que fosse potencialmente indicadora da ocorrência de respostas imunes mediadas por células B. Por fim, comparámos as características dos casos com clones MBL e CLL estereotipados vs. não estereotipados. De forma geral, foram detetados três grupos principais de clones com padrões distintos, mas parcialmente sobrepostos, relativamente ao uso dos genes IGHV, ao estado mutacional desses genes e às alterações citogenéticas: 1) um grupo enriquecido em clones MBLlow expressando genes IGHV específicos (p.e. VH3-23) sem alterações citogenéticas ou com alterações isoladas de bom prognóstico; 2) um grupo principalmente constituído por clones MBLhigh e estágios avançados de CLL com um repertório IGHV restrito, mas diferente (p.e., VH1-69), muitas vezes associado com cariótipos complexos e alterações citogenéticas de mau prognóstico, e; 3) um grupo com características intermédias, com prevalência de genes IGHV mutados e com números mais elevados de células clonais B del(13q)+. Estes resultados sugerem que as características do BCR de clones de células B com fenótipo de CLL podem modular o tipo de alterações citogenéticas adquiridas pela célula transformada, a sua taxa de aquisição, e eventualmente também, as suas consequências clínicas. Tal como referido anteriormente, os resultados recentes apoiam a existência em doentes com CLL, de uma estimulação crónica subjacente das células B por um conjunto restrito de epítopos. Neste sentido, expansões de ≥ 2 clones de células B têm sido frequentemente relatadas em B-CLPD, principalmente na MBL, a qual parece constituir um epifenómeno de estimulação antigénica crónica e persistente. Assim, foi colocada a hipótese de a multiclonalidade se encontrar associada com características particulares do BCR indicando uma maior probabilidade de interação com determinantes imunológicos partilhados. A análise comparativa de clones de células B com fenótipo de CLL e com fenótipo não-CLL de casos de MBL, CLL/B-CLPD multiclonais vs. monoclonais mostrou que, nos casos multiclonais o BCR clonotípico apresenta um grau ligeiramente maior de homologia de HCDR3, juntamente com características hematológicas e citogenéticas únicas, que estão tipicamente associadas com os estágios iniciais da doença. De entre estes casos foi ainda identificado um subgrupo de clones de células B (coexistentes) filogeneticamente relacionados que exibiam características moleculares e citogenéticas únicas. No seu conjunto, esses resultados apoiariam a natureza de tais expansões de células B multiclonais associada ao Ag e o potencial envolvimento de múltiplos epítopos em promover o desenvolvimento da MBL e favorecer a sua progressão para doença (p.e., LLC). No entanto, o cenário no qual podem ocorrer esses eventos permanece desconhecido. De forma a ganhar um maior conhecimento acerca deste cenário, na última parte do nosso trabalho, investigamos ainda a potencial relação entre uma hematopoiese alterada/ clonal e o estímulo antigénico durante a expansão dos clones de CLL e MBL estereotipados vs. não estereotipados. No geral, os casos estereotipados exibiam mais frequentemente genes IGHV1 em vez de IGHV3, juntamente com sequências HCDR3 mais longas e genes IGHV não mutados. O tamanho dos clones de células B estereotipados no sangue periférico (PB) não mostrou estar relacionado com o seu perfil citogenético, mas sim com a presença de imunofenótipos associados com mielodisplasia em células mielóides do PB. Tal associação particular sugere que o surgimento e/ou expansão de clones de células B de CLL nestes casos estereotipados pode ser favorecido por uma hematopoiese alterada subjacente. Em conclusão, os nossos resultados destacam o potencial envolvimento de diferentes vias induzidas pelo Ag nos estágios iniciais de desenvolvimento da MBL e de transformação para CLL, onde o reconhecimento de múltiplos epítopos pelo BCR, juntamente com a coexistência ou não de uma hematopoiese alterada subjacente, poderão modular os padrões de aquisição de alterações citogenéticas na patogénese da CLL, através de diferentes vias de transição desde os estágios de MBL multiclonal até aos clones de CLL monoclonal com perfis citogenéticos mais complexos.
Increasing knowledge exists about the mechanisms involved in the pathogenesis of B-cell chronic lymphoproliferative disorders (B-CLPD). Generally, tumor cell survival and/or proliferation depend both on the genetic abnormalities of neoplastic cells and the tumor microenvironment. Therefore, the development and widespread of molecular techniques for the characterization of both tumor cell genetic alterations and B-cell receptor (BCR) features, have been pivotal in the understanding of B-CLPD. As a consequence, chronic lymphocytic leukemia (CLL) is now considered as the prototype for several B-cell diseases where microenvironmental interactions, rather than a specific genetic abnormality, are critical in the onset, expansion and even progression of the disease, in at least a fraction of cases. Thus, a biased repertoire of the immunoglobulin heavy chain variable region (IGHV) genes with a particular mutational status, or even closely homologous antigen (Ag) binding sites among otherwise unrelated cases (“stereotyped” BCR), is generally considered as evidence for the involvement of a limited set of Ags, superantigens or both, in the development of CLL, fostering research about the early phases of the disease, e.g. monoclonal B-cell lymphocytosis (MBL). In this regard, flow cytometry has facilitated the identification of MBL cases with (MBLhigh) or without (MBLlow) absolute B-lymphocytosis which precedes most CLL cases, allowing the investigation of potential mechanisms involved in the transition from such MBL precursor states to overt CLL. Since tumorigenesis is a multi-step process, the first transforming events may occur at earlier stages, either directly in the normal counterpart of a CLL cell or perhaps, even in the hematopoietic stem cell compartment of CLL patients. In order to address this issue, in the present doctoral thesis we investigated multiple phenotypic and BCR features of clonal B-cells and their microenvironment in a relatively large series of MBL, CLL/B-CLPD clones, from both monoclonal and multiclonal cases. In order to explore whether particular Ag could be involved in specific cytogenetic pathways during early oncogenesis, we first investigated the potential association between unique cytogenetic profiles and specific IGHV repertoires. In a second step, we compared the BCR and cytogenetic features of B-cell clones from monoclonal vs. multiclonal cases to determine whether or not the latter were associated with a higher BCR homology, potentially reflecting occurrence of B-cell mediated immune responses. Finally, we compared the features of stereotyped vs. non-stereotyped MBL and CLL cases. Overall, we detected three major groups of clones with distinct but partially overlapping patterns of IGHV gene usage, mutational status and cytogenetic alterations: 1) a group enriched in MBLlow clones expressing specific IGHV genes (e.g. VH3-23) with no or isolated good-prognosis cytogenetic alterations; 2) a group which mainly consisted of MBLhigh and advanced stage CLL with a skewed, but different, IGHV gene repertoire (e.g. VH1-69), often associated with complex karyotypes and poor-prognosis cytogenetic alterations, and; 3) a group with intermediate features, prevalence of mutated IGHV genes and higher numbers of del(13q)+ clonal B-cells. Altogether, these results suggest that BCR features of CLL-like B-cell clones may modulate the type of cytogenetic alterations acquired by the transformed cell, their rate of acquisition, and potentially also, their clinical consequences. As referred above, recent findings support the existence of underlying chronic B-cell stimulation by a restricted set of epitopes in CLL. In line with this, expansion of ≥2 B-cell clones has been frequently reported in B-CLPD, mainly in MBL, which could be an epiphenomenon of a chronic and persistent antigenic stimulation. Thus, we hypothesized that multiclonality could be associated with particular BCR features indicating a greater probability of interaction with shared immunological determinants. Comparative analysis of CLL-like and non-CLL-like B-cell clones from multiclonal vs. monoclonal MBL, CLL/B-CLPD cases showed clonotypic BCR of multiclonal cases have a slightly higher degree of HCDR3 homology, together with unique hematological and cytogenetic features, which are typically associated with earlier disease stages. Among these cases a subgroup of phylogenetically related (coexisting) B-cell clones which displayed unique molecular and cytogenetic features, was identified. Altogether, these results would support the Ag-driven nature of such multiclonal B-cell expansions and the potential involvement of multiple epitopes in promoting the development of MBL and favor their progression into full disease (e.g. CLL). However, the scenario in which these events occur, remains unknown. In order to gain insight into the above scenario in the last part of our work we further investigated the potential relationship between an altered/clonal hematopoiesis and antigenic driving forces, during the expansion of stereotyped vs. non-stereotyped CLL and CLL-like MBL clones. Overall, former cases more frequently used IGHV1 rather than IGHV3 genes, together with longer HCDR3 and unmutated IGHV sequences. The overall size of the stereotyped B-cell clones in peripheral blood (PB) did not appear to be associated with their cytogenetic profile but it was more closely related to presence of myelodysplasia-associated immunophenotypes on PB myeloid cells. Such unique association suggests that the emergence and/or expansion of CLL-like B-cell clones in these stereotyped cases could be favored by an underlying altered hematopoiesis. In conclusion, our results highlight the potential involvement of different Ag-driven pathways in the early stages of development of MBL and transformation to CLL, where BCR recognition of multiple epitopes together with the co-existence or not of an underlying altered hematopoiesis, would modulate further patterns of acquisition of cytogenetic alterations in the pathway to CLL, through different transitional stages from multiclonal MBL to monoclonal CLL clones carrying more complex cytogenetic profiles.
Description: Tese de doutoramento em Biociências, no ramo de Biologia Celular e Molecular, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/26349
Rights: openAccess
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