Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/25841
Title: Avaliação molecular dos mecanismos envolvidos na sensibilidade e resistência ao Imatinib independente do BCR-ABL em leucemia mielóide crónicas
Authors: Alves, Raquel Fernanda da Silva 
Orientador: Ribeiro, Ana Bela Sarmento Antunes da Cruz
Vale, Maria da Graça dos Santos Pratas do
Keywords: Leucemia mielóide crónica; Imatinib; Transportadores de influxo e Efluxo; Novos fármacos dirigidos a alvos moleculares; Moduladores de glicoproteína-P
Issue Date: 2011
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: A Leucemia mielóide crónica (LMC) é uma doença clonal mieloproliferativa que se caracteriza pela presença do gene fusão BCR-ABL. Este gene codifica o alvo terapêutico desta patologia, a oncoproteína BCR-ABL que possui actividade tirosina cinase desregulada. O tratamento de primeira linha em LMC é um inibidor tirosina cinase, o Imatinib, que bloqueia especificamente a actividade da oncoproteína BCR-ABL. Contudo, apesar dos bons resultados obtidos com esta terapêutica são conhecidos casos de resistência, cujos mecanismos moleculares podem ser mediados por múltiplas vias. Além das mutações no gene BCR-ABL, a resistência ao Imatinib pode resultar de alterações nos transportadores de influxo e efluxo, condicionando assim a concentração de fármaco acumulado no interior das células. Além destes factores, a oncoproteína BCR-ABL tem a capacidade de activar múltiplas vias de sinalização celular, que são particularmente responsáveis pelo aumento da capacidade de proliferação e pela resistência à apoptose. Assim, o conhecimento sobre os mecanismos moleculares envolvidos em todo este processo possibilitará o uso de novos fármacos na LMC. Os objectivos deste trabalho foram avaliar os mecanismos envolvidos na resistência ao Imatinib, em particular o envolvimento dos transportadores de influxo, OCT1 e OCTN2, e de efluxo, P-gP e de BCRP, e o potencial terapêutico do L-744,832 (inibidor da farnesiltransferase), do Everolimus (inibidor do mTOR) e da Reversina 205 (inibidor da P-gP) na modulação da resistência, num modelo in vitro de LMC. Para tal, foi utilizada a linha celular K562, a partir da qual foram geradas duas sublinhas resistentes ao Imatinib, as células K562 RC e K562 RD. Os níveis de expressão dos transportadores membranares, nomeadamente do OCT1, do OCTN2, da P-gP e do BCRP, foram determinados por citometria de fluxo recorrendo a anticorpos marcados com sondas fluorescentes. Através de ensaios de cinética com radiofármacos foi avaliada a actividade funcional da P-gP. De forma a avaliar os efeitos dos diversos fármacos na viabilidade celular, recorreu-se ao ensaio metabólico com resazurina, após as várias Resumo | IV linhas celulares terem sido incubadas na ausência e na presença dos compostos. A morte celular foi avaliada por microscopia óptica (coloração de May-Grünwald-Giemsa), por citometria de fluxo com a dupla marcação anexina V e iodeto de propídeo e pela avaliação dos níveis de expressão de proteínas envolvidas nos processos de morte celular, como a BAX, FAS e as caspases. Nas células resistentes observou-se diminuição dos níveis de expressão de OCT1 e OCNT2, acompanhados por aumento da expressão de P-gP e BCRP comparativamente com as células sensíveis, K562, sugerindo uma contribuição destes transportadores na resistência ao Imatinib. Além disso, e concordante com o resultado anterior, verificou-se uma diminuição na percentagem de captação do radiofármaco em relação ao observado na linha celular sensível. Os ensaios com o L-744,832, o Everolimus e com a Reversina 205, evidenciaram que estes compostos, em monoterapia, têm um efeito maioritariamente citotóxico quer na linha sensível quer nas resistentes, induzindo morte celular preferencialmente por apoptose. Estes resultados foram confirmados tanto pela microscopia óptica (características morfológicas de apoptose) como pelos níveis de expressão de moléculas mediadoras da apoptose. Adicionalmente, a associação entre os diversos fármacos e o Imatinib revelou um efeito sinergístico, o que sugere que estas associações além de benéficas pela redução da toxicidade dos fármacos, poderão ser úteis para ultrapassar a resistência ao Imatinib. Por outro lado, a Reversina 205 mostrou-se útil na modulação da resistência ao Imatinib, tendo-se observado re-sensibilização das células para este inibidor de tirosina cinase. Em conclusão, os resultados sugerem o envolvimento dos transportadores de influxo e efluxo na aquisição de resistência ao Imatinib, sendo possível re-sensibilizar as células resistentes pela administração simultânea de Imatinib e Reversina 205. Adicionalmente, conclui-se que a utilização de outros inibidores da via de sinalização celular a jusante à da oncoproteína poderá vir a ser uma nova abordagem terapêutica no tratamento de LMC.
Chronic myeloid leukaemia (CML) is a mieloproliferative disorder characterized by the presence of the BCR-ABL gene fusion, which encodes an oncoprotein with a deregulated tyrosine kinase activity. This oncoprotein became the main therapeutic target of the disease. In fact, the first-line therapy is Imatinib, a specific tyrosine inhibitor that blocks BCR-ABL tyrosine kinase activity. Although, the good results with Imatinib, the development of drug resistance is a reality and can be mediated by different pathways. Besides the BCR-ABL mutations, the resistance can be mediated by the increase of drug efflux transporters expression, which contributes to the decrease of drug concentration in the leukemia cells. In addition to this problem, this oncoprotein activates multiple cell signaling pathways, particularly responsible for the enhancer in cellular proliferation and resistance to apoptosis. Therefore, the knowledge of these changes would enable the use of new drugs in CML. The aims of this study were to evaluate the mechanisms involved in resistance to Imatinib, particularly the involvement of influx (OCT1 and OCTN2) and efflux transporters (P-gP and BCRP), and the therapeutic potential of L-744, 832 (inhibitor farnesiltransferase), Everolimus (an inhibitor of mTOR) and Reversina 205 (inhibitor of P-gp) in Imatinib resistance modulation of, using an in vitro model of CML For this purpose, we used a CML cell line, the K562 cells, and generated two sub-cell lines resistant to Imatinib, the K562-RC and K562-RD cells. Drug influx and efflux transporters expression levels, namely OCT1, OCTN2, PgP and BCRP, were evaluated through flow cytometry (FC) using monoclonal antibodies labeled with fluorescent probes. The functionality of PgP was assessed using radiosensitizer (99mTc Sestamibi) kinetic studies. To evaluate the effect of new targeted drugs on cell viability, all cell lines were treated in absence and presence of different drug’s concentrations and analyzed by the resazurin assay. Cell death was determined by optical microscopy (May-Grünwald-Giemsa staining), by FC using the annexin V and Abstract | VIII propidium Iodide double staining and by the expression levels of molecules involved in cell death. In resistant cells were observed a decrease in OCT1 and OCTN2 expression levels and an increase in P-gP and BCRP expression compared with the sensitive cell line, which may contribute to the resistance to Imatinib. According with this, the results show a decrease in the uptake profile of the radiosensitizer, comparing with the sensitive cell line, demonstrating the P-gP functionality. On the other hand, the new drugs tested in these cell lines revealed mostly a cytotoxic effect in sensitive and resistant cells, and induces cell death by apoptosis in a time- and dose- dependent manner. These results are confirmed by optical microscopy (apoptotic morphological characteristics) and by the increase in death molecule’s expression. The combination of new drugs with Imatinib showed a synergistic effect, suggesting that besides the decrease in the toxicity, this combination may be useful in circumventing Imatinib resistance. Therefore, Reversin 205 may modulate Imatinib resistance, and could re-sensitize the cells to this tyrosine kinase inhibitor. In conclusion, our results suggest the involvement of drug’s transporters in acquisition of resistance to Imatinib, and the use of Reversin 205 might circumvent this resistance. Additionally, our results propose that inhibition of other pathways beyond BCR-ABL oncoprotein can be used as a new potential therapeutic approach in the treatment of CML.
Description: Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/25841
Rights: openAccess
Appears in Collections:FCTUC Ciências da Vida - Teses de Mestrado
UC - Dissertações de Mestrado

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