Importância do TRAIL e da Survivina como alvos terapêuticos na Leucemia Linfoblástica Aguda

Abstract

A Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) representa um grupo de doenças biologica e clinicamente heterogéneo. A quimioterapia continua a ser a terapêutica mais utilizada, no entanto, muitos doentes desenvolvem mecanismos de resistência aos fármacos convencionais, nomeadamente por resistência à apoptose, associados ao aparecimento de recidivas hematológicas frequentes. O TRAIL (TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand) ou APO2L (APO 2 ligand), é uma proteína transmembranar do tipo II, com capacidade selectiva de indução de morte celular. Esta citocina pode ligar-se a dois tipos de receptores da membrana celular: os receptores de morte celular 4 e 5 (DR4/TRAIL-R1 e DR5/TRAIL-R1) induzindo morte celular por apoptose; e os receptores armadilha (ou decoy) 1 e 2 (DcR1/TRAIL-R3 e DcR2/TRAIL-R4), que inibem a apoptose. Para além disto, verifica-se que apesar do TRAIL induzir apoptose de forma preferencial nas células cancerígenas, nem todas as células tumorais apresentam sensibilidade ao TRAIL, nomeadamente pelo aumento da expressão de proteínas anti-apoptóticas, como a survivina. Neste sentido, encontramse em estudo vários moduladores da resistência à apoptose, nomeadamente os compostos naturais Ácido Gambógico (GA) e Silibinina (SLB). Tendo em conta estas observações pretendeu-se com este trabalho avaliar a eficácia terapêutica do rhTRAIL, e dos fármacos inibidores da survivina, GA e SLB, em monoterapia e em combinação terapêutica, entre si e com a quimioterapia convencional, em células de Leucemia Linfoblástica Aguda, em particular na recidiva da doença, bem como analisar alguns dos mecanismos envolvidos na citotoxicidade e na sensibilidade das células a estes compostos. Para tal, as células CEM e MOLT-4, obtidas de doentes com LLA de linhagem T (LLA-T) na fase de apresentação da doença e na recidiva hematológica, respectivamente, foram mantidas em cultura na ausência e na presença de concentrações crescentes destes fármacos, em monoterapia (em toma única e em administração diária) e em associação terapêutica entre si e com a quimioterapia convencional (Doxorrubicina e Vincristina), administrados simultaneamente e desfasados de 4 horas. A proliferação e viabilidade celular foram avaliadas pelo teste de exclusão com azul de tripano e o tipo de morte celular foi analisado por microscopia óptica, através da análise morfológica com solução de May-Grünwald-Giemsa, e por citomeria de fluxo (CF) recorrendo à dupla marcação com anexina V e Iodeto de Propídeo (IP). Os níveis de caspase 3, de citocromo c, bem como o ciclo celular e o potencial de membrana mitocondrial foram avaliados por CF com recurso a anticorpos monoclonais específicos, ao IP e à sonda fluorescente JC1, respectivamente. Os níveis de expressão basal do ligando TRAIL e dos seus receptores, do receptor da transferrina (TfR), bem como da survivina, foram também avaliados por CF. Assim, os resultados obtidos neste trabalho mostram que os fármacos em estudo induzem diminuição na proliferação e viabilidade celular de forma dependente da dose, do tempo de exposição, do tipo de administração e da linha celular em estudo. Os efeitos citotóxicos induzidos pelos diferentes compostos são mediados por apoptose, acompanhados de aumento da expressão de caspase 3 activada e de citocromo c, bem como de disfunção mitocondrial. As alterações ao nível do ciclo celular revelam aumento da população celular em G0/G1 e o aparecimento de pico apoptótico confirmando a morte celular por apoptose. A diferença na sensibilidade das células ao rhTRAIL pode estar relacionada com a razão entre os receptores pró- e antiapoptóticos do TRAIL, a qual é superior nas células CEM em relação às células MOLT-4. Estes resultados podem justificar a maior sensibilidade das células CEM ao rhTRAIL. Além disso, os níveis de expressão basal da survivina e do receptor da transferrina (TfR) são também superiores nas células CEM, podendo explicar a maior sensibilidade destas células ao GA e a necessidade de maiores concentrações de SLB, para obter os mesmos efeitos que nas células MOLT-4. Adicionalmente, a administração diária e a associação entre os diversos fármacos revelou efeito sinérgico, o que sugere que estas associações para além de benéficas pela redução da toxicidade dos fármacos, poderão ser úteis para ultrapassar a resistência ao sinal efectivo de morte celular mediada pelo rhTRAIL. Em suma, podemos concluir que os fármacos rhTRAIL, GA e SLB poderão constituir uma abordagem terapêutica promissora em leucemias agudas, nomeadamente na recidiva da doença, quer em monoterapia quer em terapêutica combinada com a quimioterapia convencional.

Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) represents a biologically and clinically heterogeneous group of diseases. Although, chemotherapy is a hallmark for ALL treatment many patients relapse. Take into account, development of new therapeutical approaches to treat these neoplasias may be explored. One promising approach in treatment of haematological neoplastic malignancies is the use of tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis inducing ligand (TRAIL/Apo-2L). TRAIL is a member of the TNF superfamily with a selective apoptotic activity. This protein trigger and activate 2 death receptors, DR4 and DR5, that induce cell death by apoptosis; and 2 decoy receptors, DcR1 and DcR2, which in contrast with the pro-apoptotic receptors inhibit apoptosis. Nevertheless, in some cases treatment with TRAIL alone may not be sufficient for an effective response, namely by the increased of anti-apoptotic survivin levels. The natural compounds Gambogic Acid (GA) and Silibinin (SLB) appear to be a potential treatment to increase apoptotic response. In this work, the main objective is to evaluate the therapeutic efficacy of a recombinant human TRAIL (rhTRAIL) and survivin inhibitors, namely gambogic acid (GA) and silibinin (SLB), alone and in combination with conventional chemotherapeutic agents, in Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) cell lines, namely in relapse, as well as the mechanisms that are involved in cytotoxicity and sensitivity for these compounds. For this purpose we maintained in culture two ALL cell lines, the CEM (obtained from a patient at disease presentation) and MOLT-4 cells (established a patient at relapse), and tested the effect of different concentrations of rhTRAIL, GA and SLB in monotherapy (single administration and at a low daily administration), in association with each other and with conventional drugs (Doxorubicin or Vincristine), administrated simultaneously or 4 hours offset. Cell viability and proliferation were assessed by the trypan blue assay; cell death was analyzed by optical microscopy (May- Grunwald-Giemsa stain) and by flow cytometry (FC) using the Annexin V and Propidium Iodide (PI) double staining. Activated caspase 3 and cytocrome c, mitochondrial dysfunction and cell cycle analyze were accessed by FC using monoclonal antibodies, JC1 fluorescent probe and IP, respectively. TRAIL, TRAIL Receptors, survivin and TfR (transferin receptor) basal levels were evaluated by FC using monoclonal antibodies. Our results show that all the tested drugs have an antiproliferative and cytotoxic effects in a dose, time, type administration and cell line dependent manner. The results obtained by FC and morphological analyses show that the cell death occurs mainly by apoptosis with increase of activated caspase 3 and cytocrome c levels as well as mitochondrial dysfunction. In cell cycle analyze we observed that rhTRAIL, GA and SLB induce cell cycle arrest in G0/G1 phase and in pre G0/G1 which confirm cell death by apoptosis. The different therapeutic efficacy of rhTRAIL in both cell lines may also be correlated with the ratio between TRAIL pro and anti-apoptotic receptors, which are higher in CEM than in MOLT-4, in contrast with survivin and TfR levels. On the other hand, the combination of new rhTRAIL with survivin inhibitors and conventional drugs showed a synergistic effect, suggesting that besides the decrease in the toxicity, this combination may be useful in circumventing resistance for an effective apoptotic response. In conclusion, our study suggests that rhTRAIL and survivin inhibitors, in monotherapy or in combination, may constitute a new potential therapeutic approach to overcome treatment failure and relapse in ALL treatment.