Characterization of human umbilical cord matrix mesenchymal stem cells isolated and cultured on tunable hydrogel-based platforms

Abstract

Está descrito que as células mesenquimais estaminais (MSCs) são extremamente reactivas à modulação por mecanotransdução (Chen, 2008; Eyckmans et al., 2011; Moore et al., 2010), nomeadamente através da expressão tipica de genes especificos da linhagem de certos tecidos quando cultivados in vitro em substratos com propriedades mecanicas similares ás dos mesmos. Nomeadamente, as MScs quando cultivadas em substratos com rigídez semelhante a dos tecidos neuronais (1-10 kPa) expressam genes neuronais (Engler et al., 2006)Também tem sido discrito que estas células parecem reter algum tipo de memoria relacionada com a rigídez dos subtratos em que estiveram cultivadas (Tse et al., 2011). Normalmente as MSCs são isoladas e cultivadas em placas de cultura de poliestireno e so depois de vários passagens transferidas para substratos apropriados para determinar a sua pasticidade em termos de expressão de marcadores de linhagem celular especifica , como já descrito nos casos de “compromisso” dos tipos osteogénico, miogénico e neurogénico (Engler et al., 2006). No entanto, as MSCs podem reter alguma “memoria” do contacto anterior com o poliestireno de rigidez extremamente alta quando comparada a de tecidos humanos, possivelmente diminuindo o potencial em termos de diferenciação (em termos de compromisso com as diferentes linhagens celulares). É do nosso interesse perceber quais serão os efeitos de isolar as MSCs directamente em substratos com rigidez similar a dos tecidos neuronais em termos do seu potencial para expressar marcadores neuronais. Propomos então isolar e cultivar MSCs da matriz do cordão umbilical humano (hUCM) directamente em substratos mais moles, nomeadamente, hidrogéis semelhantes em rigidez ao tecido neuronal (1 a 10 kPa). Como control parte da matriz do cordão umbilical de cada amostra irá ser usado para isolar MSCs usando o protocolo base em placas de cultura de tecidos de poliestireno (TCPs) (Secco et al., 2008) sendo depois transferidas para hidrogéis similares após algumas passagens em poliestireno (P1-P5), para verificar se a cultura prolongada em poliestireno rigo é um factor de restrição na sua capacidade de expressar marcadores neuronais após a cultura em plastico. Para promover a adesão das MSCs aos hidrogéis para a isolação e cultura, estes vão ser covalentemente funcionalizados com colagénio (Engler et al., 2006) e em alguns casos fibronectina. vi Conseguimos optimizar um novo protocolo para isolar MSCs humanas do cordão umbilical, permitindo-nos obter uma população de MSCs humanas indiferenciadas mais homogenea quando comparado com o protocolo de isolação em TCPs. Os hidrogéis de poliacrilamida (PA) usados para a isolação já são utilizados comumente em experiencias de mecanotransdução, mas tanto esta formulação dos hydrogéis como a isolação das hUCM-MSCs em hidrogeis, nunca foi feito antes à luz do nosso conhecimento. Podemos concluir que a FN juntamente com a rigidez do substrato tem um papel importante na proliferação inicial das MSCs humanas quando cultivadas em substratos moles, nomeadamente a 10kPa (Figura 17). Os resultados preliminares (Figuras 18, 19 e tabela III) mostram o que parece ser uma população de MSCs humanas mais indeferenciada e mais homogeneas quando isoladas e cultivadas nos hidrogéis de PA. Finalmente, parece-nos que certos marcadores neuronais (B-III tubulin, Nestin, O4 e GFAP) estão mais expressos nas células já em diferenciação cultivadas nos hidrogéis moles do que nas cultivadas e em diferenciação no plástico (TCP), isto para as células expandidas durante 5 passagens no plástico (TCPs). Em relação as MSCs humana isoladas exclusivamente nos hidrogéis de PA as diferenças entre estas e as MSCs isoladas no plastico não são muito evidentes, mas parece que o O4 está mais expresso nas células isoladas em hidrogéis moles de PA.

It is described that Mesenchymal Stem Cells (MSCs) are extremely responsive to modulation by mecanotransduction (Chen, 2008; Eyckmans et al., 2011; Moore et al., 2010), namely by expressing typical lineage-specific genes when cultured in vitro on substrates with mechanical properties similar to those of the target tissues. Namely, MSCs express neural genes when cultured on substrates compliant with neural tissues (1-10 kPa) (Engler et al., 2006). It has also been described that these cells seem to retain some memory related to the stiffness of the substrates in which they were previously cultured on (Tse et al., 2011). Typically, MSCs are isolated and cultured on polystyrene culture dishes (Tse et al., 2011) and eventually transferred onto compliant substrates after several passages to assess their plasticity in terms of lineage-specific expression markers, as reported in case of osteogenic-, myogenic- or neural-like commitment (Engler et al., 2006). Nevertheless, MSCs might retain memory (Tse et al., 2011) from the extremely high stiffness of polystyrene, possibly restraining their full potential in terms of lineage commitment. It is of interest to understand what would be the effect of isolating MSCs directly on substrates with stiffness similar to that of neural tissues in terms of their potential to express neural markers. We propose to isolate and culture human umbilical cord matrix MSCs directly on softer substrates, namely hydrogels compliant with neural tissue (1 to 10KPa). As a control, part of the umbilical cord matrix of every sample will be used to isolate MSCs using normal tissue-culture polystyrene plates (the typical isolation and culture protocol) (Secco et al., 2008) and then transferred onto similar hydrogels after several passages on polystyrene (P1-P5), to address if prolonged culture on hard polystyrene is restraining their capacity to express neural markers later on. To promote the attachment of MSCs onto the hydrogels for isolation and culture, these will be covalently functionalized with collagen (Engler et al., 2006) and Fibronectin. We optimized a new hMSCs isolation protocol for MSCs from UCM, allowing us to obtain naive hMSCs with a more homogenous population when compared to the isolation in TCPs. The PA hydrogels used for the isolation are commonly used in mechanotransduction experiments, but neither this specific formulation neither the iv isolation of hUCM-MSCs was ever done before in PA hydrogels to the best of our knowledge. We can conclude that FN together with substrate stiffness have an important role in the initial proliferation impulse of hMSCs when cultured on soft substrates, namely at 10kPa (Figure 17). Preliminary results (Figure 18, 19 and Table III) show what appears to be a more naive and more homogenous population of hMSCs isolated and cultured on the PA hydrogels. Finally, it seems that neural markers (B-III tubulin, Nestin, O4 and GFAP) are more expressed in differentiating hMSCs plated on soft hydrogels than on plastic for hMSCs expanded for 5 passages on plastic. In terms of hMSCs isolated exclusively on PA hydrogels, the differences between these and hMSCs isolated on plastic were very evident, but O4 seems to be more expressed in cells isolated on soft PA hydrogels.