Evaluating injury signals and regeneration enhancers following a central nervous system injury

Abstract

Axónios do sistema nervoso periférico são capazes de regenerar após uma lesão através da ativação de um programa de regeneração com o transporte de sinais de lesão do local de lesão para o corpo celular. Estes sinais de lesão irão então induzir a expressão dos potenciadores de regeneração. Pensa-se que ambos os sinais de lesão induzidos e os potenciadores de regeneração expressos após uma lesão no sistema nervoso central (SNC) são defeituosos. Durante a última década, têm havido esforços intensivos na tentativa de entender a razão pela qual axónios falham a regeneração no SNC adulto de mamíferos, tendo por objetivo encontrar uma estratégia para uma terapia efetiva para promover a regeneração após patologias no sistema nervoso central, como a lesão na espinal medula. Esta tese focou na caracterização dos sinais de lesão e potenciadores de regeneração que possam ativar a capacidade de regeneração intrínseca celular de neurónios do SNC. Identificámos a glicogénio sintase quinase 3 beta (GSK3β), a proteína de choque térmico 40 (Hsp40) e a Rho associada à proteína-quinase 2 (RockII) como sinais aumentados após uma lesão na raiz dorsal que podem atuar como potenciais inibidores da regeneração. Quer a GSK3β como a RockII foram já descritas no contexto de regeneração axonal como moléculas que necessitam de ser inibidas de forma a obter níveis ótimos de regeneração axonal. No caso da Hsp40, o seu papel não está tão bem estabelecido e deverá ser posteriormente analisado. Neste contexto, estamos a explorar a sua relevância durante o crescimento axonal pela realização de ensaios de crescimento de neurites após knockdown por shRNA em neurónios primários. A segunda parte deste trabalho focou a identificação de potenciadores de regeneração e mecanismos subjacentes ao aumento no transporte axonal em axónios em regeneração. Identificámos a proteína do gene do produto 9.5 (PGP9.5) e a proteína mediadora de resposta de colapso-5 (CRMP-5) como dois possíveis potenciadores da regeneração axonal, com aumento de transporte anterógrado em axónios em regeneração. No entanto, knockdown de ambos os candidatos não inibiu o crescimento de neurites in vitro. Estudos futuros devem ser efetuados para clarificar os seus papéis durante o crescimento axonal, nomeadamente avaliando o crescimento axonal em neurónios knockdown para CRMP-5 e PGP9.5, quando crescidos em condições que mimetizam o ambiente inibitório de uma lesão no SNC tal como, usando como substrato mielina. Em relação ao aumento do transporte axonal em axónios em regeneração investigámos se este processo se poderia dever a alterações nos motores moleculares ou a alterações nas modificações pós- transducionais da tubulina. Embora tenhamos observado alterações quer na expressão da quinesina, quer na de dineína, os níveis destes motores por si só não foram suficientes para explicar as alterações observadas no transporte axonal. Ainda em relação aos motores, dado que a fosforilação das cadeias leves da quinesina tem sido descrita como sendo responsável pela libertação da quinesina dos microtúbulos, analisámos esta modificação em axónios em regeneração, não tendo sido encontrada nenhuma correlação que possa explicar este aumento no transporte. O envolvimento das modificações pós-transducionais da tubulina também foi investigado. Como a acetilação da tubulina foi descrita como uma modificação da tubulina que aumenta a ligação dos motores, começámos por analisá-la. No entanto, não se observaram nenhumas diferenças nos níveis de tubulina acetilada em axónios em regeneração. Vimos no entanto, que os níveis de tubulina tirosinada estavam aumentados em axónios em regeneração, o que sugere um aumento de quantidade de microtúbulos dinâmicos. Em resumo, este trabalho contribuiu para a identificação de possíveis novos sinais de lesão e potenciadores de regeneração. A sua relevância no contexto da lesão na espinal medula irá futuramente ser estabelecida.

Peripheral nervous system axons are able to regenerate following an injury through the activation of a regeneration program with transport of injury signals from the site of lesion to the cell body. These injury signals will then induce the expression of regeneration enhancers. Both the injury signals induced and the regeneration enhancers expressed after a central nervous system (CNS) injury are thought to be defective. During the past decade, there have been intensive efforts in trying to understand why axons fail to regenerate in the adult mammalian CNS aiming at finding an effective therapeutic strategy to promote regeneration after CNS pathology such as spinal cord injury (SCI). This thesis has focused on characterizing injury signals and axonal regeneration enhancers that may activate the cell-intrinsic regeneration capacity of CNS neurons. We have identified glycogen synthase kinase 3 beta (GSK3β), heat shock protein 40 (Hsp40) and Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase 2 (RockII) as signals increased after a dorsal root injury that may act as potential regeneration inhibitors. Both GSK3β and RockII were already described in the context of axonal regeneration as molecules that need to be inhibit in order to obtain optimal levels of axonal growth. In the case of Hsp40 its role is not as well established and should be further addressed. In this context, we are further exploiting its relevance during axonal growth by performing neurite outgrowth experiments following its knockdown through shRNA delivery in primary neurons. The second part of this work focused on the identification of regeneration enhancers and on the mechanisms underlying the increase in axonal transport in regenerating axons. We have identified protein gene product 9.5 (PGP9.5) and collapsin response mediator protein 5 (CRMP-5) as two possible axonal regeneration enhancers with increased anterograde transport in regenerating axons. However knockdown of both candidates did not inhibit neurite outgrowth in vitro. Further studies should be performed to clarify their role during neurite outgrowth, namely by assessing the neurite outgrowth in neurons following knockdown for CRMP-5 and PGP9.5, when grown in conditions mimicking the inhibitory environment of a CNS injury i.e., when grown on myelin as a substrate. Regarding the increase of axonal transport in regenerating axons, we investigated whether this could be due to alterations on molecular motors or to alterations in tubulin post-translation modifications. Although we have observed alterations in both kinesin and dynein expression, their levels alone were not sufficient to underlie the alterations observed in axonal transport. In relation to motors, as kinesin light chain (KLC) phosphorylation has been described as being responsible for releasing kinesin from microtubules, we analyzed this modification in regenerating axons, but no correlation was found that could underlie increased transport. The involvement of the tubulin post-translational modifications was also investigated. As tubulin acetylation was described as a tubulin modification that increases binding of motors, we started by analyzing it. However, no differences were observed in the levels of acetylated tubulin in regenerating and non-regenerating axons. We found however, that the levels of tyrosinated i.e., dynamic microtubules, were increased in regenerating axons. In summary, this work contributed to identify possible new injury signals and regeneration enhancers. Their relevance in the context of spinal cord injury will be further established in the future.