Purificação e Caracterização de uma Protease do Pólen de Chenopodium sp.

Abstract

Os pólenes de plantas anemófilas são importantes indutores de doenças alérgicas, como a asma e a rinite. O pólen quando é hidratado, para além de libertar uma diversidade de alergénios, liberta também proteases. Estas podem desempenhar um papel relevante na sensibilização alérgica, uma vez que levam à fragilização da barreira epitelial, potenciando o contacto entre os alergénios e células do sistema imunitário. Podem também activar receptores específicos de proteases, que levam, por sua vez, a uma resposta inflamatória através da libertação de citocinas próinflamatórias e do recrutamento de células Th2. Para além disso, as proteases são capazes de clivar moléculas envolvidas na regulação da homeostase pulmonar, o que potencia ainda mais o desenvolvimento de reacções inflamatórias. Vários estudos têm demonstrado que a presença de actividade proteolitica em materiais alergénicos é responsável por potenciar a resposta alérgica. No entanto, poucos são os estudos em pólenes que se focam em purificar e caracterizar as proteases possivelmente responsáveis pelos mecanismos inerentes à sensibilização alérgica. Consequentemente, surge a necessidade de efectuar este tipo de estudo, de modo a poder encontrar possíveis alvos terapêuticos e tentar reduzir o impacto das doenças alérgicas. O pólen da planta Chenopodium sp. possui uma alergenicidade moderada e encontra-se bastante disseminado pela zona mediterrânica. Estudos anteriores conseguiram demonstrar a presença de proteases neste pólen, responsáveis pelo aumento da permeabilidade numa linha celular do epitélio humano (Gaspar, R., 2012). Neste trabalho procedeu-se à purificação da protease maioritariamente responsável por essa actividade, utilizando uma série de processos cromatográficos sequenciais: exclusão molecular, troca iónica e afinidade. Este processo de purificação permitiu isolar parcialmente uma protease de cerca de 60 kDa e de baixo pI . Posteriormente, a protease purificada foi caracterizada através de ensaios de inibição com vários inibidores para as diversas classes proteolíticas conhecidas. O perfil de inibição obtido apresenta maior semelhança com metaloaminopeptidases. Para além disso, este perfil X é semelhante ao obtido anteriormente para o extracto polínico de Chenopodium sp., o que pode indicar que a protease purificada é a principal responsável pela actividade enzimática obtida nesse extracto. Com o objectivo de avaliar o efeito da protease purificada na integridade da barreira epitelial recorreu-se às linhas celulares epiteliais células Calu-3 e MDCK. As células Calu-3 foram utilizadas para ensaios de permeabilidade transepitelial, enquanto que as MDCK foram utilizadas para estudos da degradação dos complexos proteicos intercelulares. A protease purificada não conseguiu induzir nenhum aumento da permeabilidade transepitelial, nem degradar proteinas das junções de oclusão, nomeadamente Claudina-1 e Ocludina. Por outro lado o extracto polínico de Chenopodium sp. continou a exercer um aumento da permeabilidade transepitelial, resultante da disrupção de proteínas constituintes das junções de oclusão. Esta disrupção foi inibida parcialmente na presença de um inibidor de proteases, o que indica que estas enzimas interferem de facto com a integridade da barreira epitelial.

Anemophilous plants are important inductors of allergic disorders, like asthma and rhinitis. The hydration of the pollen grain leads to the release of a diversity of allergens but also proteases. These proteases may play an important role in allergic sensitization, leading to epithelium barrier breakdown, which allows allergens to contact cells of the immune system. They can also stimulate protease-activated receptors, leading to an inflammatory response, due to the release of proinflammatory cytokines and Th2 cell recruitment. Furthermore, proteases can cleave molecules involved in pulmonary homeostasis, which further enhances the development of inflammatory reactions. Several studies have demonstrated that protease activity in allergenic materials is responsible for enhancing the allergic response. However, there are few studies that focus on purifying and characterizing proteases that could be responsible for mechanisms of allergic sensitization. Thus, there is a great need to carry out such studies in order to find out potential therapeutic targets and try to reduce the impact of allergic diseases. Chenopodium sp. pollen has a moderate allergenicity and is quite widespread over the Mediterranean area. Previous studies have demonstrated the presence of pollen proteases, responsible for the increased permeability in a human epithelial cell line (Gaspar, R., 2012). In this study, we proceeded to purify the protease mostly responsible for this activity using series of sequential chromatographic processes: molecular exclusion, ion exchange and affinity. This purification process allowed the partial isolation of a 60 kDa protease with low pI. After that, the purified protease was characterized by inhibition assays with inhibitors for the various proteolytic classes known. The inhibition profile obtained shows greater similarities with metalloaminopeptidases. Beside that, this profile is similar to the previously obtained for Chenopodium sp. pollen extract, which may indicate that the purified protease is primarily responsible for the proteolytic activity of this extract.In order to evaluate the effect of purified protease in epithelial barrier integrity we used Calu-3 and MDCK epithelial cell lines. Calu-3 cells were used for transepithelial permeability assays, whereas MDCK were used to study disruption of intercellular protein complexes. The purified protease failed to induce an increase of transepithelial permeability, and to degrade tight junction proteins, namely Claudin-1 and Occludin. On the other hand, Chenopodium sp. pollen extract continued to increase transepithelial permeability, resulting from disruption of tight junctions proteins. This disruption was partially inhibited in the presence of a protease inhibitor, which indicates that these enzymes do interfere with the epithelial barrier integrity.