Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/24603
Title: Impact of H9c2 cardiomyoblast differentiation on isoproterenol toxicity : different modulation of signaling pathways
Other Titles: Influência do estado de diferenciação de cardiomioblastos H9c2 na toxicidade induzida pelo isoproterenol : diferente modulação de vias de sinalização
Authors: Branco, Ana Filipa Roque 
Orientador: Oliveira, Paulo
Santos, Maria Sancha
Keywords: isoproterenol; receptores β-adrenérgicos; vias de sinalização apoptóticas; mitocôndria; mioblastos H9c2; diferenciação
Issue Date: 2012
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: The chronic exposure of cardiomyocytes to catecholamines is associated with pathologic alterations. Stress conditions and tissue insults trigger the activation of neurohormonal systems and catecholamine synthesis is consequently increased. The binding of circulating catecholamines to adrenergic receptors normally incurs in physiological responses that comprises increasing contractile force, heart rate, metabolic activity, among other effects that affect cardiac performance. However, hyperadrenergic stimulation, resulting from sustained activation of β- adrenergic receptors (β-AR), is thought to be directly involved in cardiomyocyte apoptosis. Over-activation of specific signaling pathways results in several cellular processes which lead to progressive myocardium deterioration and contribute toward decompensated heart failure. In this regard, the present work addresses the mechanisms by which cardiac cells respond to an overstimulation of β-AR according to their differentiation state (i. e. embryonic/adult). For this objective, we used the rat myoblastic H9c2 cell line which can be differentiated in adult skeletal or cardiac muscle cells. The synthetic catecholamine isoproterenol (ISO) was used to stimulate β-AR since its specificity represents an advantage when compared with endogenous catecholamines. Our hypothesis is that β-AR over-stimulation results in different cell fates depending on the differentiation stage of the cell. This approach is relevant since most studies are conducted in H9c2 cells in their undifferentiated state (embryonic) raising questions on its applicability to cardiotoxicity studies. Initial characterization of H9c2 differentiation was performed concerning differences in terms of intrinsic cell defenses and signaling pathways which may render cells more or less susceptible to ISO. The alteration in cellular physiology during differentiation was strengthened by gene array analyses showing up-regulation of mitochondrial metabolism genes and genes encoding calcium transporters and differentiation markers, in retinoic acid-differentiated H9c2 cells. In what concern ISO-induced toxicity, the present work demonstrates that undifferentiated cells have increased resistance to ISO, which can be 16 explained by increased anti-apoptotic proteins including Bcl-2 and BclxL and intrinsic defense capacity such as MnSOD. Several stress responses were increased in differentiated cells, including p66Shc, p53 and Bax, at the same with higher mitochondrial degeneration. This was particularly seen by mitochondrial depolarization, loss of respiratory complexes and oxidative stress, which was mostly observed in differentiated H9c2 cells. Moreover, after ISO treatment, differentiated H9c2 cells showed increased cAMP, cytosolic calcium accumulation, cleavage of PARP and activation of caspase 3. Alterations in calcineurin and p38-MAPK in undifferentiated and differentiated cells can also account for the larger toxicity of ISO in the latter. Moreover, the increase in pro-apoptotic proteins was not accompanied in increased antiapoptotic counterparts, as occurred in undifferentiated myoblasts (BclxL, Bcl-2). We conclude that H9c2 cells present differential regulation of stress responses during their differentiation which impact the toxicity of several agents. In conclusion, the present thesis demonstrates that undifferentiated and differentiated H9c2 cells possess different susceptibility to the β-AR agonist ISO in which the balance between pro- and anti-apoptotic pathways are involved. The results are relevant from a basic toxicology point of view, since this cell line is very used as a model for cardiac cells. Furthermore, the data supplies evidence that the H9c2 cell line can be used as a framework to investigate developmental cardiotoxicity.
A exposição crónica de cardiomiócitos a catecolaminas está associada a alterações patológicas. Condições de stress e lesões no tecido cardíaco activam sistemas neurohormonais que induzem a consequente síntese de catecolaminas. A interacção de catecolaminas com receptores adrenérgicos induz respostas fisiológicas como o aumento da força de contracção muscular, aumento da actividade metabólica, entre outros efeitos que afectam o desempenho cardíaco. Contudo, a estimulação adrenérgica resultante de uma activação prolongada de receptores β-adrenérgicos (β-AR) pode estar directamente envolvida na apoptose de cardiomiócitos contribuindo para insuficiência cardíaca descompensada. A sobre-activação de vias de sinalização específicas resulta na estimulação de vários processos celulares que conduzem á deterioração progressiva do miocardio. Neste sentido, o presente trabalho pretende investigar os mecanismos pelos quais células cardíacas respondem à sobre-activação de β-AR segundo o seu estado de diferenciação (embrionário/adulto). Com este objectivo, usamos a linha celular mioblastica de rato H9c2 que tem a capacidade de ser diferenciada em células musculares esqueléticas e cardíacas. A catecolamina sintética isoproterenol (ISO) foi usada no sentido de estimular β-AR já que a sua especificidade representa uma vantagem quando comparada com o uso de catecolaminas endógenas. A nossa hipótese de trabalho é que a sobre-activação de β-AR resulta em diferentes respostas dependendo do estado de diferenciação celular. Dado que a maior parte dos estudos conduzidos em células H9c2 usa esta linha celular no seu estado indiferenciado (embrionário), questões relativas á sua aplicabilidade em estudos cardiotóxicos levantam algumas dúvidas. A caracterização inicial do processo de diferenciação de H9c2 foi realizada tendo em conta diferenças em termos de defesas celulares intrínsecas e vias de sinalização que poderão induzir maior ou menor sensibilidade das células ao ISO. A alteração de processos fisiológicos nas células foi ainda investigada através de análise genética mostrando que genes envolvidos no metabolismo mitocondrial, na differenciação 18 celular e na codificação de transportadores de cálcio, estão sobreexpressos em células H9c2 diferenciadas em presença de ácido retinóico. O presente trabalho demonstra que células indiferenciadas apresentam maior resistência ao ISO, o que pode ser explicado pelo aumento de proteinas anti-apoptóticas tais como Bcl-2 e Bcl-xL, e na capacidade de defesa intrínseca tais como MnSOD. Múltiplas respostas a condições de stress encontram-se aumentadas em células diferenciadas, incluíndo proteinas p66Shc, p53 e Bax bem como degeneração mitocondrial. Esta última, identificada através da despolarização mitocondrial, perda de complexos respiratórios e stress oxidativo, que foi maioritariamente observado em celulas H9c2 diferenciadas. Após tratamento com ISO, em células H9c2 diferenciadas verifica-se um aumento de cAMP, acumulação de cálcio no citosol, clivagem da PARP e activação de caspase-3. As alterações nas proteínas calcineurina e p38-MAPK nas células indiferenciadas e diferenciadas podem também contribuir para uma maior toxicidade ao ISO nas últimas. O aumento de proteínas proapoptóticas não foi acompanhado por um concumitante aumento de próteinas anti-apoptóticas, como verificado em células indiferenciadas (Bcl-xL e Bcl-2). Concluímos que as células H9c2 apresentam uma regulação diferencial em resposta a condições de stress durante a sua diferenciação o que influencia a toxicidade de agentes cardiotóxicos. Em conclusão, o presente trabalho demonstra que células H9c2 indiferenciadas e diferenciadas possuem diferente susceptibilidade ao agonista de β-AR, ISO, sendo neste processo, o balanço entre proteínas pro- e anti-apoptóticas de grande importância. Os resultados são relevantes do ponto de vista toxicológico básico já que esta linha celular é normalmente utilizada como modelo para células cardíacas. Os resultados obtidos evidenciam que a linha celular H9c2 poderá ser utilizada em estudos que visam investigar a resposta cardiotóxica a fármacos, no entanto, há que ter presente que diferentes estados de diferenciação poderão influenciar diferentes susceptibilidades a vários agentes. Além disso, os resultados evidenciam que a linha H9c2 pode ser usada (como ferramenta) para investigar a cardiotoxicidade durante o desenvolvimento.
Description: Tese de doutoramento em Biologia na especialidade Biologia Celular apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/24603
Rights: openAccess
Appears in Collections:FCTUC Ciências da Vida - Teses de Doutoramento

Files in This Item:
File Description SizeFormat
Tese_Ana Branco.pdf9.25 MBAdobe PDFView/Open
Show full item record

Page view(s) 50

484
checked on Sep 21, 2020

Download(s)

120
checked on Sep 21, 2020

Google ScholarTM

Check


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.