Estudos toxicológicos de materiais nano-estruturados de carbono. Algumas aplicações farmacológicas

Abstract

Este trabalho descreve um estudo da interação de suspensões aquosas de C60 e de C60(OH)18-22 com sistemas biológicos considerando modelos de complexidade crescente, das membranas aos organismos, passando pelos organelos e células. Enquanto a preparação de suspensões aquosas de C60(OH)18-22 foi realizada por dissolução direta em água, tendo dado lugar a nanopartículas com diâmetro inferior a 3 nm e potencial Zeta de cerca de -37 mV, a obtenção de suspensões aquosas de C60 obrigou a uma dissolução prévia em tolueno, seguida de transferência para água, produzindo nanopartículas de 33 nm e potencial Zeta de cerca de -25 mV. As características físicas das nanopartículas não sofreram alteração nos meios que mimetizaram as condições fisiológicas dos sistemas biológicos. Estudos de supressão de fluorescência mostraram que os fulerenos partilham extensivamente tanto em modelos membranares como em membranas nativas e incorporam em regiões distintas da membrana. C60 apresenta valores de coeficiente de partilha cerca de 6 vezes superiores aos de C60(OH)18-22 e localiza-se preferencialmente no interior hidrofóbico da membrana ao passo que C60(OH)18-22 prefere regiões próximas dos grupos polares dos fosfolípidos. Os efeitos dos fulerenos na atividade do sistema respiratório mitocondrial, tomada como ilustrativa de uma função celular residente na membrana e fortemente influenciada por agentes que interagem com os componentes da membrana e alteram a sua topologia, foram investigados seguindo as flutuações do potencial elétrico transmembranar, a despolarização induzida pelo ADP e o consumo de oxigénio promovido por diferentes substratos. Foi demonstrado que, na mesma gama de concentrações, C60 exerce uma toxicidade mitocondrial mais severa do que C60(OH)18-22, traduzindo-se por aumento da permeabilidade passiva da membrana interna a protões e inibição da atividade dos complexos respiratórios, sem afetar o sistema fosforilativo. Todavia, C60(OH)18-22 a concentrações superiores à máxima utilizada de C60, inibe a atividade da FoF1-ATPsintase. A um nível de complexidade biológica mais elevado e num contexto de toxicologia ambiental, os efeitos dos fulerenos foram avaliados em dois organismos-modelo: Geobacillus stearothermophilus em representação dos microrganismos decompositores e Lemna gibba em representação das plantas fotossintéticas. Enquanto o crescimento e a estrutura morfológica da bactéria não foram afetados pelos fulerenos na gama de concentrações de 2 a 15 mg/L (para C60) e de 5 a 200 mg/L (para C60(OH)18-22) e a atividade respiratória dos protoplastos só foi inibida pelo fulereno hidroxilado a concentrações muito elevadas (≥1040 g/mg de proteína), a proliferação vegetativa da L. gibba foi fortemente reduzida por C60 (até 10 mg/L) e por C60(OH)18-22 (≥ 100 mg/L). Alterações do conteúdo em clorofilas e da atividade fotossintética de L. gibba, mais severas na presença de C60 do que de C60(OH)18-22, foram igualmente observadas. A toxicidade dos fulerenos foi também avaliada utilizando linhas celulares humanas (HeLa, neuro2a) e culturas primárias de astrócitos de rato, não tendo sido detetados efeitos tóxicos a concentrações até 15 mg/L para C60 e até 100 mg/L para C60(OH)18-22, após 24 e 48 horas de incubação. Estes resultados motivaram a investigação do potencial farmacológico destas nanopartículas. C60, ao contrário do C60(OH)18-22, mostrou capacidade de proteger as células neuro2a da toxicidade de t-butil-hidroperóxido, conhecido por induzir morte celular associada a stresse oxidativo. Já os estudos de peroxidação lipídica em mitocôndrias de fígado de rato mostraram que ambos os fulerenos são capazes de se opor à degradação oxidativa dos lípidos induzida pelo agente oxidante, sendo a proteção conferida por C60 significativamente superior à promovida pelo seu congénere hidroxilado. Estes resultados são discutidos à luz das diferenças na localização e extensão da partilha dos fulerenos nas biomembranas. Numa perspetiva de aplicação farmacológica dos fulerenos a doenças neurodegenerativas, investigou-se a possibilidade do fulereno C60 conjugar às suas propriedades antioxidantes a capacidade de funcionar como vetor de ácidos nucleicos, num contexto de terapia génica. C60, embora não tenha permitido, nas condições experimentais ensaiadas, promover a expressão de uma proteína-repórter (GFP) em células HeLa, por transfecção com um plasmídeo de DNA, revelou qualidades assinaláveis como vetor de moléculas de RNA de interferência, induzindo o silenciamento da expressão da proteína GFP em células HT-1080 e U87. Em conclusão, as propriedades físico-químicas dos fulerenos, influenciando a sua incorporação e topologia nas membranas biológicas, revelaram-se determinantes da atividade toxicológica e do potencial farmacológico daqueles compostos. Especificamente, a ausência de toxicidade em células nervosas, o efeito protetor de danos oxidativos e a capacidade de transportar ácidos nucleicos (siRNA) conferem ao C60 elevado potencial neuroprotetor.

This work, presents a study on the interaction of fullerene C60 and its derivative C60(OH)18-22 with biological systems considering models of increasing complexity, from membranes to organisms, encompassing organelles and cells. While aqueous suspensions of C60(OH)18-22 were prepared by dissolving the fullerene directly in water, generating nanoparticles with < 3 nm in diameter and -37 mV of Zeta potential, the suspensions of C60 in water were obtained by transferring the fullerene from toluene into an aqueous phase, producing nanoparticles with 33 nm in diameter and -25 mV of Zeta potential. These physical characteristics were not altered in media mimicking physiological conditions. Fluorescence quenching studies showed that fullerenes partition strongly in model and native membranes, incorporating in different regions of lipid bilayer thickness. C60, as compared with C60(OH)18-22, exhibit higher values of partition coefficient and partitioned in deeper regions of the lipid bilayer. The effects of fullerenes on the activity of mitochondrial respiratory system, taken as a cellular function residing in membranes and influenced by agents that interact with membrane components and modify their topology, were investigated by following fluctuations of transmembrane electric potential, ADP-induced depolarization and oxygen consumption supported by different substrates. In the same concentration range, C60 exerts higher mitochondrial toxicity as compared with C60(OH)18-22, reflected by increased inner mitochondrial membrane permeability to protons and inhibition of respiratory complexes, without affecting the phosphorylation system. However, at higher concentrations, C60(OH)18-22 inhibits FoF1-ATPsynthase. At a higher complexity level and in a ecotoxicological context, fullerene effects were studied in two organism models: Geobacillus stearothermophilus, as an organism carrying out nutrient recycling, and Lemna gibba, as a photosynthetic organism. While bacterial growth and ultrastructure were not affected by fullerenes in the concentration ranges of 2-5 mg/L for C60 and 5-200 mg/L for C60(OH)18-22, and bacterial protoplast respiratory activity was inhibited by C60(OH)18-22 only at very high concentrations (≥ 1040 mg per mg of protein), L. gibba growth was significantly reduced by C60 (up to 10 mg/L) and C60(OH)18-22 (≥ 100 mg/L). Alterations in chlorophyll content and photosynthetic activity of L. gibba, more pronounced in the presence of C60 than in the presence of C60(OH)18-22, were also observed. Fullerene toxicity was also assessed by using human cell lines (HeLa, neuro2a) and rat astrocyte primary cultures. No significant levels of toxicity were detected in the presence of C60 at concentrations up to 15 mg/L and of C60(OH)18-22 up to 100 mg/L, upon 24 and 48 h of incubation. These results motivated the investigation of fullerene pharmacological potential. C60, as opposed to C60(OH)18-22, showed high capacity of protection of neuro2a cells against the toxicity of t-butyl hydroperoxide, known as a cell death inducer associated with oxidative stress. However, lipid peroxidation studies on rat liver mitochondrial membranes showed that both fullerenes protect membrane lipids against oxidative degradation, C60 being more efficient than C60(OH)18-22. These results are discussed taking into account the fullerene partition and membrane localization. In a perspective of fullerene application in neurodegenerative disease therapy, the possibility of fullerene C60 to conjugate antioxidant properties to the capacity for nucleic acid delivery was explored. Although C60-containing pDNA complexes has not promoted GFP expression in HeLa cells, in the experimental conditions assayed, complexes of siRNA with C60 showed high levels of GFP silencing in HT-1080 and U87 cells. In conclusion, fullerene physical properties influence their membrane incorporation and localization, hence determining their toxicological activity and pharmacological potential. Specifically, the absence of toxicity of C60 on neuronal cells, the protection afforded by this fullerene against oxidative stress, and its capacity for siRNA delivery make C60 a promising tool for neuroprotection.