Oncogénese e Progressão do Melanoma - Análise Mutacional e Estudo Clínico Retrospectivo

Abstract

As mutações de genes que regulam a proliferação celular e a apoptose através das vias MAPK, PI3K/AKT e p16INK4A são eventos críticos na oncogénese do melanoma. Diversas mutações potencialmente patogénicas têm sido identificadas em estudos de sequenciação genómica de linhas celulares de melanoma. A biopsia do gânglio sentinela avalia a disseminação linfática do melanoma, sendo preditiva de metastização à distância e de morte relacionada com o tumor. Estando bem estabelecida em doentes de risco intermédio, permanece controversa nos doentes com melanomas espessos (>4,0 mm) devido à alta taxa de invasão linfática e de metastização distante oculta. A disseminação à distância é a principal causa de morte por melanoma e pode ocorrer por via linfática ou por via hemática. Objectivos: (i) Determinar a frequência de 29 mutações em amostras de melanoma e de nevos melanocíticos, inferindo acerca da sua relevância patogénica, (ii) avaliar o valor prognóstico do estado do gânglio sentinela nos doentes com melanomas espessos (>4,0 mm), (iii) identificar factores relacionados com a disseminação da doença loco-regional e (iv) identificar factores preditivos da via de disseminação metastática. Material e métodos: Amostras de tecido fixadas em formol e incluídas em parafina de melanomas primários (n=81) emparelhados com metástases loco-regionais (n=21) e nevos melanocíticos (n=28) foram submetidas a genotipagem de 29 mutações seleccionadas. Após extracção de DNA, cuja concentração e qualidade foi verificada por espectrofotometria e fluorimetria, as amostras foram genotipadas e a relevância patogénica de cada mutação foi avaliada com o auxílio de ferramentas bioinformáticas. O estudo clínico retrospectivo incluiu 208 doentes com melanoma observados no Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra de 2000 a 2007. As variáveis estudadas foram: sexo, idade, grupo etário, localização do melanoma, tipo de melanoma, espessura, ulceração, estado do gânglio sentinela, metastização em trânsito, metastização ganglionar regional, metastização à distância, progressão da doença loco-regional, via metastática, morte por melanoma, tempo de evolução até à metastização distante e tempo até à morte ou à última observação. Resultados: Identificaram-se 4 mutações: BAI3 D755N (em 1,2% dos doentes com melanoma), DLEC1 D215N (em 3,7% dos doentes com melanoma e em 7,1% dos nevos melanocíticos), MYO9A G2291V (em 1,2% dos doentes com melanoma) e TP63 M499I (em 1,2% dos doentes com melanoma). Todas as mutações foram observadas no tumor primário, à excepção de TP63 M499I, que só se verificou numa metástase em trânsito. Apenas DLEC1 D215N não foi apontada como deletéria pelas ferramentas bioinformáticas, mas o seu papel patogénico foi considerado possível, já que esta mutação nunca foi descrita na população geral. O estudo clínico retrospectivo revelou que a espessura foi o factor de prognóstico com maior valor preditivo da metastização em trânsito, da metastização ganglionar, da metastização à distância, da sobrevivência livre de doença e da sobrevivência global. A espessura e o sexo masculino relacionaram-se com uma maior taxa de positividade da biopsia do gânglio sentinela. O estado do gânglio sentinela foi preditivo de metastização em trânsito, de metastização à distância e de morte relacionada com o melanoma, excepto nos doentes com melanomas espessos (>4,0 mm). A sobrevivência livre de doença foi influenciada pelo estado do gânglio sentinela, mas este não teve impacto na sobrevivência global dos doentes com melanomas espessos (>4,0 mm), excepto em relação à sobrevivência a curto prazo (2,5 anos). A progressão da doença loco-regional para metastização distante (61,4% dos casos) não foi influenciada por nenhuma das variáveis estudadas. A doença metastática à distância ocorreu em 31,7% dos doentes. As metástases ganglionares foram o foco metastático inaugural em 53% dos casos, as metástases em trânsito em 30,3% e as metástases distantes em 16,7%. A sobrevivência livre de doença, a sobrevivência livre de metástases distantes e a sobrevivência global foram semelhantes nas várias vias metastáticas. Conclusões: As mutações BAI3 D755N, DLEC1 D215N, MYO9A G2291V e TP63 M499I ocorreram numa frequência reduzida nos melanomas. DLEC1 D215N foi igualmente observada em nevos melanocíticos. TP63 M499I apenas foi identificada numa metástase. O papel destes genes na oncogénese do melanoma e na nevogénese requer esclarecimento futuro. Nos doentes com melanomas espessos o prognóstico parece ser mais influenciado pela disseminação hemática à distância do que pelo estado do gânglio sentinela, embora este manifeste valor preditivo da sobrevivência livre de doença e da sobrevivência a curto prazo (2,5 anos). Não se identificaram factores clínicos relacionados com a progressão para metastização à distância em doentes com metastização loco-regional nem factores preditivos da via de disseminação do melanoma.

Genetic mutations in regulators of cell proliferation and apoptosis through MAPK, PI3K/AKT and p16INK4A pathways are critical events in melanoma oncogenesis. Several potentially pathogenic mutations have been identified in whole genome sequencing of melanoma cell lines. Sentinel lymph node biopsy assess the lymphatic spread of melanoma, predicting the risk of distant metastases and melanoma-related death. Despite being well-established for intermediate risk tumors, it is still controversial in thick melanoma (>4.0 mm) due to the high rate of lymphatic spread and occult distant metastases. Metastatic disease is the main cause of melanoma-related death. The migration of tumor cells to distant sites can occur either by lymphatic invasion either by hematic dissemination. Objectives: (i) Determine the frequency of 29 mutations in melanoma and melanocytic nevi samples, assessing their relevance in nevogenesis and melanoma pathogenesis, (ii) assess the prognostic value of sentinel lymph node status in patients with thick tumors (>4.0 mm), (iii) identify factors related with the progression of locoregional disease and (iv) identify factors underlying the metastatic route of melanoma. Material and methods: Formalin fixed paraffin embedded tissue samples of primary melanomas (n=81) paired with locoregional metastases (n=21) and melanocytic nevi (n=28) were genotyped for 29 selected mutations. After DNA isolation and spectrophotometric and fluorimetric control of DNA concentration and quality, the samples were genotyped and the pathogenic relevance of each mutation was assessed by bioinformatic tools. The retrospective clinical study was conducted on a sample of 208 melanoma patients observed in the Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra between 2000 and 2007. The variables analyzed were: sex, age, age group, site of melanoma, type of melanoma, thickness, ulceration, sentinel node status, intransit metastases, regional nodal metastases, distant metastases, progression of locoregional disease, metastatic route, melanoma-related death, time until distant metastases and time to death or time to last observation. Results: Mutational analysis identified 4 mutations: BAI3 D755N (1.2% of melanoma patients), DLEC1 D215N (3.7% of melanoma patients and 7.1% of melanocytic nevi), MYO9A G2291V (1.2% of melanoma patients) and TP63 M499I (1.2% of melanoma patients). All these mutations were observed in the primary tumor, except TP63 M499I mutation which occurred only in a sample of in-transit metastasis. Only DLEC1 D215N were not pointed as deleterious by bioinformatic tools, but was also likely to be pathogenic, considering that it had never been described in general population. The retrospective clinical study revealed that thickness was the most important predictive factor of in-transit metastases, disease-free survival and overall survival. The rate of positivity of sentinel lymph node biopsy was significantly higher in patients with thick melanomas and in males. The sentinel lymph node status showed prognostic influence on the occurrence of in-transit metastases, distant metastases and melanoma-related death, except in patients with thick melanoma (>4.0 mm). Disease-free survival was determined by sentinel lymph node status but its impact in overall survival was not observed in patients with thick melanoma (>4.0 mm), excepting in short-term survival (2.5 years). The progression of locoregional disease up to distant metastases (61.4% of cases) was not influenced by any of the variables studied. Distant metastatic disease affected 31.7% of patients. Nodal metastases were the first to arise in 53% of cases, followed by in-transit metastases in 30.3% and distant metastases in 16.7%. Disease-free survival, distant metastases-free survival and overall survival were identical regardless the metastatic route. Conclusion: BAI3 D755N, DLEC1 D215N, MYO9A G2291V and TP63 M499I mutations occurred with a low frequency in melanoma samples. DLEC1 D215N was also observed in melanocytic nevi. TP63 M499I was found in one metastasis but not in the primary tumor. The role of these genes in melanoma oncogenesis and nevogenesis needs to be clarified. In patients with thick melanoma the prognosis seems to be mostly determined by distant hematic spread with little influence of the sentinel lymph node status, but sentinel lymph node invasion retained the ability to predict a worst diseasefree survival and a poorest short-term overall survival (2,5 years). We identified no factors related with the progression to distant metastases in patients with locoregional involvement neither factors related with the metastatic route followed by the tumour.