Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/23608
Title: Assessment of JC polyomavirus in normal colorectal mucosa, hyperplastic polyps and sporadic adenomas and adenocarcinomas in a Portuguese population and its association with cancer development
Authors: Coelho, Tatiana Rasteiro 
Orientador: Almeida, Luís
Keywords: Poliomavírus JC; Cancro Colorretal
Issue Date: 16-May-2014
Citation: COELHO, Tatiana Rasteiro - Assessment of JC polyomavirus in normal colorectal mucosa, hyperplastic polyps and sporadic adenomas and adenocarcinomas in a Portuguese population and its association with cancer development. Coimbra : [s.n.], 2014. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/23608
Abstract: O poliomavírus neurotrópico humano JC (vírus JC) infeta de forma persistente e subclínica o trato gastrointestinal e urinário de cerca de 60-80% da população adulta mundial e é conhecido como o agente etiológico da Leucoencefalopatia Multifocal Progressiva em indivíduos imunocomprometidos. Recentemente, diversos estudos documentaram a deteção do genoma do vírus JC em amostras de tumores humanos quer de origem neural quer de origem não neural. De facto, sequências nucleotídicas do vírus JC e respetivas proteínas virais têm sido detetadas em diversas neoplasias humanas, incluindo no cancro colorretal. A oncogenicidade do vírus JC parece estar associada com a atividade da oncoproteína antigénio-T grande nas células hospedeiras. O antigénio-T do vírus JC tem a capacidade de desregular o controlo do ciclo celular, interagindo com proteínas supressoras de tumor, como a p53 e a pRb, o que o torna impar na capacidade de simultaneamente comprometer a integridade cromossómica e inativar os pontos de controlo do ciclo celular. Adicionalmente, o antigénio-T tende a autoperpetuar-se nas células infetadas e a imortalizar as transformadas, mediante interação com diversas outras proteínas celulares, tais como a IRS-1 e a beta-catenina. Não estando ainda estabelecida uma relação causa-efeito direta, são necessários estudos adicionais, sistematizados e bem concebidos, com o intuito de esclarecer o papel do vírus JC no desenvolvimento de cancro colorretal, na medida em que poderá ser um alvo de estratégias preventivas e terapêuticas na oncogénese colorretal. Atendendo ao facto de que o cancro colorretal apresenta uma elevada taxa de incidência na população Portuguesa, sendo a primeira causa de morte por neoplasia maligna, e que não foram, até à data, relatados estudos nesta matéria, o presente trabalho teve como principal objetivo esclarecer o papel que o vírus JC poderá desempenhar no desenvolvimento do cancro colorretal na população Portuguesa. Neste sentido, procedeu-se à avaliação: a) da frequência da infeção por vírus JC na mucosa colorretal, quer normal quer hiperplásica (pólipos), displásica (adenomas) e neoplásica (adenocarcinomas), e concomitante eliminação do vírus através da urina, numa população adulta Portuguesa padrão, b) da potencial associação entre a presença do vírus no cólon e o desenvolvimento, a gravidade e o grau das lesões colorretais, utilizando um painel de lesões com diferentes graus de hiperplasia/displasia/neoplasia, e c) do estado mutacional do gene TP53, de forma a rastrear potenciais alterações genéticas que possam atuar como co-fatores de risco na carcinogénese colorectal mediada pelo vírus JC em indivíduos infetados. Foram estudadas amostras de mucosa colorretal e de urina de 100 doentes (grupo de estudo) e de 100 indivíduos controlo (grupo controlo) com indicação para realização de biópsia ou cirurgia colorretal para diagnóstico/tratamento de patologias colorretais. A seleção dos indivíduos a incluir no grupo de estudo e no grupo controlo foi efetuada durante os procedimentos colonoscópicos e mediante a presença ou ausência de lesões colorretais. A deteção das sequências de DNA da estirpe Mad-1 do vírus JC foi efetuada por Nested-PCR, em DNA genómico obtido a partir das amostras de mucosa colorretal e de urina de ambos os grupos, utilizando dois conjuntos de primers complementares à sequência do gene viral que codifica a proteína antigénio-t pequeno. O rastreio mutacional do gene TP53 foi realizado por PCR seguida de Sequenciação Direta, utilizando DNA genómico obtido das amostras de mucosa colorrectal, quer normal quer displásica/neoplásica, de indivíduos infetados e não infetados pelo vírus JC. A presente abordagem experimental permitiu a deteção de sequências de DNA do vírus JC (JCV+) em 169 dos 200 indivíduos estudados (84,5%). O DNA viral estava presente em 90 dos 100 doentes (90%) com lesões colorretais: em 23 de 26 (89%) pólipos hiperplásicos, 39 de 42 (93%) adenomas tubulares, 7 de 7 (100%) adenomas vilosos, 9 de 11 (82%) adenomas túbulo-vilosos e 12 de 14 (86%) adenocarcinomas. Neste grupo, sequências de DNA viral foram também detetadas em 48 das 100 (48%) amostras de mucosa normal adjacente, todas elas contíguas a lesões positivas para a presença do vírus, e em 41 de 100 (41%) amostras de mucosa normal não-adjacente. Em 60 das 100 (60%) amostras de mucosa normal dos indivíduos do grupo de controlo não foi detetado DNA viral (JCV-). Identificaram-se ainda sequências de DNA do vírus em 39 das 90 (43%) amostras de urina colhidas, sem diferenças estatisticamente significativas entre as estimativas de risco calculadas para a eliminação do vírus pela urina em ambos os grupos (48% para o grupo de estudo e 37% para o grupo controlo). Num total de 81 amostras de mucosa colorretal normal infetadas pelo vírus JC, de 40 controlos e 41 doentes, a análise mutacional do gene TP53 permitiu a deteção de cinco alterações genéticas distintas (11818insC Int2, 11827G> C Int2, 11875insC Int2, 13399A> G EX6 e 19037insC Ex11, esta última ainda não descrita até à data) em 10 dos 40 controlos (25%) e 30 dos 41 doentes (73%). Nas 119 amostras de mucosa colorretal normal, negativas para a presença de DNA viral (60 controlos e 59 doentes), foi possível a deteção de uma única alteração no gene TP53 (11875insC Int2) em 5 dos 60 controlos (8%) e 13 dos 59 doentes (22%). Além disso, 74 amostras de mucosa colorretal displásica/neoplásica, 60 adenomas (55 JCV+ e 5 JCV-) e 14 adenocarcinomas (12 JCV+ e 2 JCV-), foram rastreadas para variantes do gene TP53 e quatro alterações genéticas concomitantes foram encontradas (11827G>C Int2, 12139C>G Ex4, 13399A>G Ex6 e a 19037insC Ex11) em todas as amostras estudadas. Os resultados do presente estudo parecem refletir uma condição em que as células transformadas do epitélio colorretal oferecem um ambiente mais permissivo à replicação do vírus JC, sendo a infeção efetiva mesmo nos estadios mais precoces, como por exemplo nos pólipos hiperplásicos. O vírus JC parece apresentar um tropismo específico pelas células epiteliais com algum tipo de predisposição prévia e propensas a transformação oncogénica, parecendo haver seleção clonal das células infetadas. Além disso, este estudo permitiu revelar a extensão epidemiológica da infeção pelo vírus JC, no trato gastrointestinal e urinário de uma população Portuguesa normal, e considerar a ocorrência de uma seleção biológica, das células infetadas pelo vírus, durante a tumorigénese em indivíduos com lesões colorretais. Adicionalmente observou-se que as alterações genéticas mais relevantes encontradas no gene TP53, tais como o novo polimorfismo identificado na região 3 '-UTR (19037insC Ex11) e a variante do codão 72 (12139C> G Ex4), são uma característica comum e exclusiva das células do epitélio colorretal de indivíduos infetados pelo vírus JC, especialmente aqueles com história clínica de displasia/neoplasia. Estas variantes do gene da p53 poderão, de alguma forma, estar relacionadas com a mudança do risco de desenvolvimento de cancro colorretal na presença do vírus JC. No entanto, a sua implicação no processo de carcinogénese colorretal mediada pelo vírus requer esclarecimentos adicionais.
The human neurotropic polyomavirus JC (JCV) infects, persistent- and sub-clinically, the gastrointestinal and urinary tract of 60-80% of the world adult population and causes Progressive Multifocal Leukoencephalopathy in immuno-compromised patients. Recently, a number of reports have documented the detection of JCV genome in samples derived from several types of neural and non-neural human tumours. In fact JCV DNA sequences and proteins have been detected in several human cancers, including in colorectal cancer (CRC), and its oncogenicity depends on viral large Tantigen oncoprotein (T-Ag) activity in human cells. JCV T-Ag can deregulate control of the cell cycle by interacting with the tumour suppressor proteins p53 and pRb, making it unique in the ability to simultaneously disrupt chromosomal integrity and inactivate cell cycle checkpoints. Additionally, it tends to self perpetuate within infected cells and to immortalize the transformed ones, cooperatively with a broad range of other cellular proteins, such as IRS-1 and beta-catenin. Since there is not a direct cause-effect relationship, systematic and well-designed studies are necessary to clarify the role of JCV in colorectal cancer, particularly because it can be the target of preventive measures for this type of cancer. Attending the fact that CRC has a high incidence rate in the Portuguese population, being the first leading cause of death by cancer, and that no data have been reported on this matter, this research work aimed to clarify whether JCV might have a potential role in the colorectal cancer development in the Portuguese population. Thus, we assessed: a) the frequency of the JCV infection in the colorectal mucosa, either normal or with hyperplastic (polyps), dysplastic (adenomas) or neoplastic (adenocarcinomas) colonic lesions, and the viral shedding through urine, in a standard adult Portuguese population; b) the potential association between the presence of the virus in the colon and the lesions development, severity and grade, using a panel of lesions with different grades of hyperplasia/dysplasia/neoplasia; and c) the mutational status of the TP53 gene in order to evaluate genetic alterations that might act as risk modifiers in JCV-mediated colorectal carcinogenesis in infected individuals. We studied the colorectal mucosa and urine of 100 patients (study group) and 100 healthy individuals (control group) with indication to perform colorectal biopsy or surgery for diagnosis/treatment of colorectal disorders. The selection between the study group and control group was made during colonoscopic procedures, depending on the presence or absence of colorectal lesions. In order to detect JCV Mad-1 strain DNA sequences Nested-PCR was performed in total genomic DNA obtained from both normal and abnormal colorectal mucosa and urine from both groups, using two primer sets targeted to the viral gene that encodes the small t-antigen. The mutational screening of the TP53 gene was performed by PCR amplification, followed by DNA Sequencing, using total genomic DNA obtained from either normal or dysplastic/neoplastic colorectal mucosa samples from JCV infected and non-infected individuals. We were able to detect viral nucleotide sequences in 169 of the 200 studied individuals (84.5%). JCV DNA sequences were present (JCV+) in 90 of the 100 patients (90%) with colorectal lesions: in 23 of 26 (89%) hyperplastic polyps, 39 of 42 (93%) tubular adenomas, 7 of 7 (100%) villous adenomas, 9 of 11 (82%) tubulovillous adenomas and 12 of 14 (86%) adenocarcinomas. JCV DNA was also detected in 48 of the 100 (48%) normal adjacent mucosa samples, all of them adjacent to positive colorectal lesions, and in 41 of the 100 (41%) normal non-adjacent mucosa samples. No viral DNA (JCV-) was detected in 60 of the 100 (60%) normal mucosa samples of the control group. We also detected JCV DNA sequences in 39 of the 90 (43%) collected urine samples, with no statistically significant differences between estimates of risk of viral shedding in the urine of both groups (48% for the study group and 37% for the control group). In a total of 81 normal colorectal mucosa specimens infected by JC virus, from 40 controls and 41 patients, the mutational analysis of the TP53 gene allowed the detection of five different genetic alterations (11818insC Int2, 11827G>C Int2, 11875insC Int2, 13399A>G Ex6 and a new 19037insC Ex11) in 10 of the 40 controls (25%) and 30 of the 41 patients (73%). Furthermore, from the 119 normal colorectal mucosa samples with no positivity for JCV DNA (60 controls and 59 patients) we were able to identify a single TP53 defect (11875insC Int2) in 5 of the 60 controls (8%) and 13 of the 59 patients (22%). Furthermore, 74 dysplastic/neoplastic colorectal lesions were screened for TP53 variants, 60 adenomas (55 JCV+ and 5 JCV-) and 14 adenocarcinomas (12 JCV+ and 2JCV-) from patients included in the study group, and four concomitant TP53 genetic alterations were found (11827G>C Int2, 12139C>G Ex4, 13399A>G Ex6 and 19037insC Ex11) in all the studied samples. Our observations may reflect a condition where the transformed colorectal epithelial cells offer a more permissive environment for JC virus replication, being effective even since the hyperplastic polyps not prone to carcinogenesis. JCV may have a specific tropism for epithelial cells with some inherent predisposition and prone to oncogenic transformation, with selection of the infected ones. Furthermore, we propose the epidemiological extent of the JCV infection in the gastrointestinal and urinary tracts of a normal Portuguese population, and the occurrence of a biological selection of JCV infected cells during tumourigenesis in individuals with colorectal lesions. Additionally, we propose that the most relevant genetic alterations found in TP53 gene, such as the new single nucleotide polymorphism identified in TP53 3’-untranslated region (19037insC Ex11) and the codon 72 variant (12139C>G Ex4), are a common and exclusive characteristic of the colorectal epithelium cells of JCV infected individuals, especially those with clinical history of dysplastic/neoplastic colorectal lesions. These p53 variants can be associated, in some extent, with the risk modification of JCV-mediated colorectal cancer development. However, its implication in the JCV-mediated colorectal carcinogenesis requires further elucidation.
Description: Tese de doutoramento em Ciências da Saúde, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/23608
Rights: openAccess
Appears in Collections:FMUC Medicina - Teses de Doutoramento

Files in This Item:
File Description SizeFormat
Assessment of JC polyomavirus in normal colorectal mucosa.pdfTese de Doutoramento - Documento Principal5.04 MBAdobe PDFView/Open
Show full item record

Page view(s)

193
checked on Sep 21, 2020

Download(s) 50

273
checked on Sep 21, 2020

Google ScholarTM

Check


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.