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Title: Evaluation of the potential protective effects of adenosine A3 receptor in retinal ganglion cell degeneration
Authors: Galvão, Joana Margarida Fernandes 
Orientador: Ambrósio, António
Keywords: Neuroproteção em glaucoma
Issue Date: 3-Dec-2013
Citation: GALVÃO, Joana Margarida Fernandes - Evaluation of the potential protective effects of adenosine A3 receptor in retinal ganglion cell degeneration. Coimbra : [s.n.], 2013. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/23503
Abstract: O glaucoma é uma doença ótica degenerativa, caraterizada pela atrofia do nervo ótico e perda das células ganglionares da retina (CGR). O aumento da pressão intra-ocular (PIO) é o principal fator de risco no glaucoma. Apesar do controlo da PIO com sucesso, um número significativo de doentes continua a perder a visão. Por isso, são necessárias novas estratégias para proteger as CGR e evitar a perda da visão. A adenosina é um neuromodulador do sistema nervoso central (SNC) que atua através da ativação de quatro recetores da adenosina (RA). A modulação dos RA demonstrou ser protetora contra um largo espetro de insultos cerebrais. Estudos prévios na retina, mostraram que a modulação dos recetores da adenosina demostrou ser neuroprotetora contra um insulto isquémico. Neste estudo, que teve como objetivo investigar os potenciais efeitos neuroprotetores da ativação do recetor de adenosina A3 (usando o agonista 2-Cl-IB-MECA) nas CGR, foram utilizados diferentes modelos de degeneração da retina in vitro e in vivo. Além disso, no presente estudo, foi desenvolvido um modelo de degeneração da retina utilizando dimetilsufóxido (DMSO). Em primeiro lugar, observámos que baixas concentrações (1, 2, 4 e 8% (v/v)) de DMSO induzem apoptose na retina in vivo. A toxicidade para concentrações superiores a 1% de DMSO foi confirmada in vitro numa linha de células neuronais da retina. Para isso foram usados ensaios de TUNEL e anexina V assim como um ensaio de viabilidade celular (MTT). Neste trabalho mostrámos ainda que o mecanismo pelo qual as concentrações baixas (2-4% de DMSO) induzem a morte neuronal ocorre através da translocação de AIF da mitocôndria para o núcleo e a estimulação de um via de sinalização celular independente da caspase-3, envolvendo a ativação da PARP-1. Estes resultados evidenciam que o DMSO como solvente para a administração in vivo, deve de ser usado com precaução mesmo a baixas concentrações. Todavia, propomos a injeção intravítrea de DMSO como um modelo para estudar a degeneração das células da retina. O potencial efeito neuroprotetor da ativação do recetor da adenosina A3 (RAA3) foi avaliado in vitro numa cultura de células da retina, e em culturas de explantes de retina utilizando ensaios de TUNEL e iodeto de propídio (IP). Os efeitos neuroprotetores foram ainda avaliados num modelo animal de morte das CGR induzida por injeção intravítrea de DMSO. Para imagiologia in vivo utilizou-se a técnica de deteção da apoptose de células da retina (DARC). No modelo de isquémia/reperfusão foram realizados ensaios de TUNEL e contagem de células positivas para o Brn3a. Além disso, os efeitos neuroprotetores foram ainda avaliados em dois modelos crónicos de degeneração das CGR, modelo de corte parcial do nervo ótico (CPNO) e no modelo de hipertensão ocular (HTO), após 7 dias e 3 semanas, respectivamente. Nestes modelos foi usada a técnica de imagiologia DARC para contar as células positivas para anexina V, assim como o número total das CGR utilizando um anticorpo que reconhece o Brn3a, depois do tratamento com o agonista RAA3 (2-Cl-IB-MECA). O agonista RAA3, 2-Cl-IB-MECA diminuiu o número de células marcadas com TUNEL (cultura mista de retina e explantes de retina), assim como o número de células positivas para IP in vitro. Além disso, o ensaio de TUNEL foi realizado em fatias de retina de ambos os modelos, que mostra uma diminuição no número de células positivas TUNEL após o tratamento com o agonista RAA3. Na imagiologia DARC in vivo após um modelo agudo, a morte celular induzida por DMSO houve um decréscimo do número das células positivas para anexina V marcados com fluorescência, assim como em dois modelos crónicos de degeneração RGC, o modelo CPNO e o modelo HTO. A imunorreatividade do RAA3 foi analisada por imuno-histoquímica. Observámos que a imunorreatividade do RAA3 diminui na camada das CGR nos modelos estudados. Os nossos resultados demonstram que a ativação dos RAA3 é neuroprotetora para as CGR, tanto em modelos in vitro como em modelos animais. Estes resultados sugerem que a ativação dos RAA3 poderá ter um grande potencial no tratamento do glaucoma.
URI: http://hdl.handle.net/10316/23503
Rights: embargoedAccess
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