Utilize este identificador para referenciar este registo: https://hdl.handle.net/10316/23302
Título: Neuropeptide Y in the retina : why and what for?
Outros títulos: Neuropeptídeo Y na retina : porquê? e para quê?
Autor: Carvalho, Ana dos Santos 
Orientador: Cavadas, Cláudia Margarida Gonçalves
Ambrósio, António Francisco Rosa Gomes
Palavras-chave: Neuropeptídeo y; Retina -- patologia
Data: 16-Abr-2013
Citação: CARVALHO, Ana dos Santos - Neuropeptide Y in the retina : why and what for? = Neuropeptídeo Y na retina : porquê? e para quê? Coimbra : [s.n.], 2012. Tese de doutoramento
Resumo: The retina is affected by several degenerative diseases like glaucoma, diabetic retinopathy and age-related macular degeneration (AMD). Moreover, the treatments available to treat these diseases are very scarce and not very effective. Thus the present study aims to investigate two different strategies to treat retinal degenerative diseases. First, neuropeptide Y (NPY) applied as a neuroprotective molecule. Second, R-IPS cells used as a new potential source of photoreceptors for retinal cell-based therapies. It has been claimed that glutamate excitotoxicity is responsible for neuronal cell death giving rise to several retinal neurodegenerative diseases such as glaucoma and diabetic retinopathy (Kowluru et al., 2003; Santiago et al., 2008). It is also known that neuropeptide Y and NPY receptors are widely distributed in the central nervous system, including the retina. NPY has a neuroprotective role against excitotoxicity in rat hippocampus through the activation of Y1, Y2 and/or Y5 receptors (Silva et al., 2003b; Xapelli et al., 2007). We previously showed that cultured rat retinal neural cells express NPY and NPY Y1, Y2, Y4 and Y5 receptors (Alvaro et al., 2007). Moreover, we have also demonstrated that NPY has a protective role against MDMA-induced toxicity in the retina (Alvaro et al., 2008), but the NPY receptor subtype(s) involved in the NPY neuroprotective effect were not investigated, neither their specific localization in rat retinal neural cell culture. In the present work, using rat retinal neural cell cultures and pure rat Müller cell culture, we show that NPY Y1 and Y2 receptors are present on every cell type of rat retinal cells. Neurons, as photoreceptors, bipolar, horizontal, amacrine and ganglion cells express these two types of NPY receptors. NPY Y1 and Y2 receptors are also located in macroglial cells (Müller cells and astrocytes) and microglial cells. Additionally, NPY (100 nM) pre-treatment of rat retinal neural cell culture inhibited glutamate-induced necrotic (PI-positive cells) and apoptotic (TUNEL-positive cells and caspase 3-positive cells) cell death compared to glutamate. NPY protected glutamate induced cell death of neurons (TUJ1 positive-cells), astrocytes/Müller cells (GFAP positive-cells) and microglia cells (CD11b positive-cells). Furthermore, using NPY receptor agonists and antagonists we observe that NPY Y2, Y4 and Y5 receptors activation inhibited necrotic cell death, while only the activation of Y5 receptor prevented apoptotic cell death triggered by glutamate, Other retinal degenerative diseases are characterized by the loss of photoreceptors, like retinitis pigmentosa. Pluripotent stem cells (iPS cells) obtained from fibroblasts may provide an unlimited source of photoreceptors for cell based therapies. However one limitation of this approach is the low yield of photoreceptors obtained (Comyn et al., 2010; Huang et al., 2010; Lamba et al., 2010; Tucker et al., 2011). Recently, it has also been showed that iPS cells retain a transient transcriptional and epigenetic memory of their cell of origin which affects their potential to differentiate in specific cell types. Using collagen-OKSM (pluripotency factors: Oct4, Klf4, Sox2 and c-Myc) reprogrammable mice retinas and tail fibroblast, Retinal-iPS and Fibroblats-iPS cells were generated. After characterization of pluripotency and study of photoreceptor markers expression, these cells were differentiated in photoreceptors. R-iPS cells differentiated into photoreceptors with a much higher efficiency then F-iPS cells, which indicate the importance of epigenetic memory in cellular reprogramming and differentiation. Based on previous studies showing the pro-neurogenic properties of NPY in several parts of the CNS and its role in the maintenance of human embryonic stem (hES) cells self-renewal and pluripotency (Son et al., 2011), we investigate the NPY system in these cells. We detected the expression of NPY and NPY Y1 receptors on R-iPS cells. Moreover, we performed 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU)-Flow cytometry proliferation assay and evaluated the expression of two different proliferation markers: EdU and Ki-67, in the presence and absence of NPY. NPY did not shown a proliferative effect in R-iPS cells. In summary, 1) NPY and NPY receptors might be considered potential targets to treat diseases, such as glaucoma and diabetic retinopathy, 2) R-iPS cells are a new potential source of photoreceptors for cell-based therapies. Therefore, we believe that NPY and R-iPS cells will open new perspectives to treat degenerative diseases in the retina.
A retina é atingida por várias doenças degenerativas, como o glaucoma, a retinopatia diabética e a degenerescência macular associada à idade. Os tratamentos disponíveis para estas doenças são escassos e pouco eficazes. Assim, os principais objetivos deste trabalho são investigar duas estratégias distintas para o tratamento de doenças degenerativas da retina. Uma das abordagens consiste na aplicação do neuropeptídeo Y (NPY) como uma molécula neuroprotetora enquanto a outra compreende a utilização de células pluripotentes induzidas de retina como potencial fonte de fotorrecetores para terapias de base celular. A excitotoxicidade induzida pelo glutamato encontra-se associada à morte neuronal indutora do aparecimento de doenças degenerativas da retina (Kowluru et al., 2003; Santiago et al., 2008). O NPY e os seus recetores encontram-se distribuídos pelo sistema nervoso central, incluindo a retina. Sabe-se também que o NPY possui um papel neuroprotetor contra a excitotoxicidade do glutamato em hipocampo de rato através da ativação dos recetores Y1, Y2 e/ou Y5 do NPY (Silva et al., 2003b; Xapelli et al., 2007). O nosso grupo mostrou também anteriormente que células neurais de retina de rato em cultura expressam o NPY e os seus recetores (Y1, Y2, Y4 e Y5) (Alvaro et al., 2007). Demonstrámos ainda que o NPY apresenta um papel protetor contra a toxicidade induzida pela MDMA em retina de rato (Alvaro et al., 2008), contudo os recetores do NPY envolvidos neste efeito ainda não foram investigados. Encontrava-se ainda por investigar a localização específica dos recetores do NPY nas células neurais de retina de rato em cultura. Nesta tese, utilizando células neurais de retina de rato em cultura e células de Müller de rato em cultura mostrámos que os recetores Y1 e Y2 do NPY se encontram presentes em todos os tipos de células da retina. Neurónios, tais como fotorrecetores, células bipolares, horizontais, amácrinas e ganglionares expressam estes dois tipos de recetores do NPY. Os recetores Y1 e Y2 encontram-se também expressos em células da macroglia (células de Müller e astrócitos) e da microglia. Além do mais, o tratamento de células neurais de retina de rato em cultura com NPY (100nM) inibe a morte celular por necrose e apoptose induzida pelo glutamato. Observa-se uma redução do número de células positivas para iodeto de propídeo, tal como do número de células positivas para o TUNEL ou para a caspase 3. O NPY protege neurónios (positivos para a TUJ1), astrócitos e células de Müller (positivos para GFAP) e células da microglia (positivas para CD11b) da morte celular induzida pelo glutamato. Por outro lado, a utilização de ferramentas farmacológicas, tais como agonistas e antagonistas dos recetores do NPY, permitiram determinar que a ativação dos recetores Y2, Y4 e Y5 do NPY inibem a morte por necrose, enquanto a ativação dos recetores Y5 do NPY previne a morte celular por apoptose induzida pelo glutamato. Outras doenças degenerativas da retina, como a retinite pigmentosa, são caraterizadas pela perda de fotorrecetores. Células pluripotentes induzidas de fibroblastos podem constituir uma fonte inesgotável de fotorrecetores para terapias de base celular. Contudo, uma das limitações desta estratégia é o baixo rendimento de fotorrecetores obtidos (Comyn et al., 2010; Huang et al., 2010; Lamba et al., 2010; Tucker et al., 2011). Recentemente, foi demonstrado que as células pluripotentes induzidas retêm uma memória epigenética transitória das suas células de origem que alteram o seu potencial em se diferenciar num tipo específico de células. Através do uso de retinas e fibroblastos da cauda de murganhos reprogramados com os fatores de pluripotência (Oct4, Klf4, Sox2 e c-Myc) foram geradas células pluripotentes de retina (R-iPS) e de fibroblastos (F-iPS). Após a caraterização da pluripotência e estudo da expressão de marcadores de fotorrecetores, estas células foram diferenciadas em fotorrecetores. As células pluripotentes obtidas da retina diferenciaram com maior eficiência que as provenientes de fibroblastos. Desta forma, confirma-se a importância de memória epigenética na reprogramação e diferenciação de células pluripotentes induzidas.Com base em estudos prévios que mostraram as propriedades pró-neurogénicas do NPY em várias zonas do sistema nervoso central e o seu papel na manutenção da renovação e pluripotencia de células estaminais embrionárias humanas (Son et al., 2011), investigámos o sistema NPY nas células R-IPS. Estas células expressam NPY e os recetores Y1 do NPY. Além disso, através da técnica de proliferação por citometria de fluxo com o 5-etinil-2-deoxiuridina (EdU) e imunocitoquímica para dois marcadores de proliferação (EdU e Ki-67), na presença e ausência de NPY, concluiu-se que o NPY não apresenta um efeito proliferativo em células R-iPS. Em conclusão: 1) o NPY e os seus recetores poderão ser considerados potenciais alvos no tratamento de doenças, tais como o glaucoma e a retinopatia diabética. 2) as células pluripotentes induzidas provenientes de retina poderão ser uma nova fonte de fotorrecetores para técnicas de base celular. Desta forma, quer o NPY, quer as R-iPS poderão, no futuro, abrir novas perspectivas no tratamento de doenças degenerativas da retina.
Descrição: Tese de doutoramento em Farmácia, na especialidade de Farmacologia e Farmacoterapia, sob a orientação da professora Doutora Cláudia Margarida Gonçalves Cavadas e do professor Doutor António Francisco Rosa Gomes Ambrósio, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra.
URI: https://hdl.handle.net/10316/23302
Direitos: openAccess
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