Unravelling New Roles for SIRT1 in Mitochondrial Biollogy

Abstract

Mitochondria are key players in the maintenance of cellular homeostasis, as they provide the energy required for the cellular processes. As such, disruption in mitochondrial homeostasis is closely associated with disease state, caused by subtle alterations in the function of tissues or by major defects, which might lead to death. Therefore, regulation of mitochondrial homeostasis is extremely important for the cell, and is dependent on the regulation of mitochondrial mass through its production (biogenesis). Indeed, physiologic stimuli can activate signaling pathways that coordinate the communication between the nuclear and mitochondrial genomes to produce efficient mitochondria, and adapt the metabolism of the cell. Sirtuin1 (SIRT1) is a metabolic sensor that has been shown to be associated with several metabolic and age-related diseases, which are also correlated with disruption of mitochondrial homeostasis. SIRT1 has been shown to regulate mitochondrial biogenesis by activating the master regulator of mitochondrial biogenesis, peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha (PGC-1α), however the role of SIRT1 in mitochondrial biology in vivo remains yet to be studied, due to lack of appropriated animal models. As so, this work aimed to investigate the role of SIRT1 in mitochondrial biology, as well as its potential involvement in the mitochondrial-related beneficial effects of two natural compounds with therapeutic potential, resveratrol and berberine. Using an adult-inducible whole body SIRT1 knockout mouse, the work in this thesis showed that SIRT1 has a dual role in the regulation of mitochondrial metabolism. On one hand, in conditions of low nutrient supply, SIRT1 activates PGC-1α and thereby induces mitochondrial biogenesis. On the other hand, in this thesis is presented for the first time, that in conditions of normal nutrient supply SIRT1 regulates mitochondrial DNA and the expression of mitochondrial-encoded genes through regulation of mitochondrial transcription factor A (TFAM) promoter. This mechanism is PGC-1α independent and mediated by a hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF1α) and myelocytomatosis viral oncogene homolog” (c-Myc) pathway. Indeed, loss of SIRT1 leads to HIF1α stabilization and consequently to an imbalance between the expression of nuclear and mitochondrialencoded genes that culminates in mitochondrial dysfunction. In addition, its shown that this PGC-1α independent pathway is also relevant for the development of age-related mitochondrial dysfunction. Indeed, here its shown that increasing SIRT1 activity in old mice reverses mitochondrial dysfunction, promotes functional communication between nuclear and mitochondrial-encoded genes as well as reverses the age-induced HIF1α stabilization. Lastly, here is also analysed the role of SIRT1 in the effects of both resveratrol and berberine in the maintenance of mitochondrial homeostasis. Resveratrol and berberine are natural compounds that have been demonstrated to protect from metabolic disturbances frequently associated with decline in mitochondrial function. Importantly, and in accordance with the pivotal role of SIRT1 in mitochondrial biology, both resveratrol and berberine were unable to preserve mitochondrial biogenesis and function from either high fat diet or hyperglycemic conditions in the absence of SIRT1. Giving further support to this, overexpression of SIRT1 in vivo showed an increase in mitochondrial function and biogenesis in the skeletal muscle. Together, these results show that increasing SIRT1 leads to increase mitochondrial biogenesis and consequently to more efficient mitochondria and represents an advantage in conditions of mitochondrial overload, such as high nutrient supply. Importantly, both resveratrol and berberine were previously shown to activate another metabolic sensor, the AMPactivated kinase (AMPK). AMPK and SIRT1 have many common targets as well as overlapping effects in the cell, therefore the epistasis of SIRT1 and AMPK have been hard to dissect. Here its shown not only that SIRT1 overexpression is sufficient to activate AMPK in the skeletal muscle, but also that SIRT1 is required for the ability of resveratrol and berberine to activate AMPK at moderated doses. Together the work presented in this thesis, show for the first time the role of SIRT1 in mitochondrial biology in vivo, as well as the importance of SIRT1 for the biological effects of resveratrol and berberine. In addition, this work also unravels a new pathway, regulated by SIRT1 and independent of PGC-1α, that regulates mitochondrial homeostasis and plays an important role in the development of age-related mitochondrial dysfunction. As such, the work presented in this thesis supports the idea that activation of SIRT1 is an important therapeutic strategy for the treatment of age and metabolic-related disorders where mitochondrial homeostasis is disturbed.

As mitocôndrias são consideradas as centrais energéticas da célula, e desempenham um papel central na manutenção da homeostasia celular, uma vez que são elas que produzem a energia necessária para a execução dos processos celulares. Desta forma, distúrbios na homeostasia mitocondrial estão intimamente associados a estados de doença, causados por alterações subtis na função de cada órgão, sendo que alterações mais dramáticas podem culminar em morte. Assim sendo, a regulação da homeostasia mitocondrial é em última análise extremamente importante para a manutenção do equilíbrio celular. Tal está dependente da regulação da massa mitocondrial (biogénese). Estímulos fisiológicos diversos ativam vias de sinalização que coordenam a comunicação entre os genomas nuclear e mitocondrial, permitindo a formação de mitocôndrias eficientes. A Sirtuina 1 (SIRT1) é um sensor metabólico que tem sido implicado no desenvolvimento de patologias metabólicas e relacionadas com a idade, as quais também se relacionam com perturbações no equilíbrio mitocondrial. A SIRT1 modula a biogénese mitocondrial mediante a ativação do principal regulador deste processo, o co-activador do receptor activado por proliferadores de peroxissoma gamma 1 alfa (PGC-1α). No entanto, o papel da SIRT1 na biologia mitocondrial in vivo permanece ainda por estudar, devido à falta de modelos animais adequados. Assim sendo, este trabalho teve como objetivo investigar o papel da SIRT1 na biologia mitocondrial, bem como o seu possível envolvimento nos efeitos benéficos mitocondriais de dois compostos naturais com potencial terapêutico, o resveratrol e a berberina. Estudos conduzidos em murganhos em que o knockout para a SIRT1 é induzido na idade adulta, demostram um papel duplo da SIRT1 na regulação do metabolismo mitocondrial. Por um lado, nesta tese é demonstrado que, em condições de reduzida disponibilidade de nutrientes, a SIRT1 ativa o PGC-1α e, assim, induz a biogénese mitocondrial. Por outro lado, é também demonstrado pela primeira vez que, em condições normais de disponibilidade de nutrientes, a SIRT1 regula o ADN mitocondrial e a expressão de genes codificados pelo ADN mitocondrial, através da regulação do promotor do factor de transcrição mitocondrial A (TFAM). Este mecanismo é independente da ativação do PGC-1α, sendo regulado por uma via de sinalização mediada pelo factor de transcrição induzível por hipóxia 1 alfa (HIF1α) e pelo protooncogene “myelocytomatosis viral oncogene homolog” (c–Myc). De fato, a perda de SIRT1 leva à estabilização do HIF1α e, consequentemente, a um desequilíbrio entre a expressão de genes codificados pelos genomas nuclear e mitocondrial, culminando em disfunção mitocondrial. Adicionalmente, é também demonstrado nesta tese que esta via independente de PGC-1α parece ser relevante para a disfunção mitocondrial associada ao envelhecimento. De facto, os resultados aqui apresentados, demostram que o aumento da atividade da SIRT1 em murganhos idosos consegue reverter a disfunção mitocondrial, promovendo a comunicação funcional entre os genomas nuclear e mitocondrial, bem como reverte a estabilização do HIF1α causada pelo envelhecimento. Por último, é também aqui analisado o papel da SIRT1 nos efeitos do resveratrol e da berberina na manutenção da homeostasia mitocondrial. O resveratrol e a berberina são compostos naturais protetores em situações de distúrbio metabólico, frequentemente associados ao declínio da função mitocondrial. De facto, e em conformidade com o papel central da SIRT1 na biologia mitocondrial, tanto o resveratrol como a berberina, na ausência de SIRT1, não têm a capacidade de preservar a biogénese e função mitocondriais do dano causado por uma dieta rica em gordura ou por condições de hiperglicémia. Da mesma forma, a sobreexpressão de SIRT1 in vivo, resulta num aumento da biogénese e função mitocondriais no músculo esquelético. Estes resultados demostram que o aumento da SIRT1 leva a um aumento da biogénese mitocondrial e consequentemente a mitocôndrias mais eficientes, o que é benéfico por exemplo em condições de sobrecarga de nutrientes, evitando assim o dano mitocondrial existente nestas situações e consequentemente mantendo a homeostasia celular. Foi previamente demonstrado que o resveratrol e a berberina conseguem ativar outro sensor metabólico, a cinase activada por AMP (AMPK). Atendendo a que AMPK e SIRT1 partilham alvos moleculares, os seus efeitos celulares muitas vezes sobrepõemse, dificultando a clarificação da epistasia entre SIRT1 e AMPK. Neste trabalho, é não só demonstrado que a sobrexpressão da SIRT1 é suficiente para activar a AMPK no músculo esquelético, como também que a SIRT1 é necessária para a activação da AMPK em condições de tratamento com doses moderadas de resveratrol e de berberina. Em conclusão, o trabalho apresentado nesta tese, demonstra, pela primeira vez, o papel da SIRT1 na biologia mitocondrial in vivo, bem como a importância da SIRT1 para os efeitos biológicos do resveratrol e da berberina. Além disso, este estudo identifica também uma nova via, regulada pela SIRT1 e independente do PGC-1α, que modula a homeostasia mitocondrial e desempenha um papel importante no desenvolvimento da disfunção mitocondrial associada ao envelhecimento. Desta forma, os resultados apresentados nesta tese sustentam a ativação da SIRT1 como uma importante estratégia para o tratamento de doenças relacionadas com o envelhecimento e distúrbios metabólicos, em que existam desequilíbrios na função mitocondrial.