Pharmacological screening of essential oils for identification of lead compounds to target inflammatory bowel disease

Abstract

Doença Inflamatória Intestinal (DII) é o termo utilizado para descrever a inflamação crónica do trato gastrointestinal. As formas principais da DII são a Colite Ulcerosa e a Doença de Chron. Embora a etiologia da DII não seja totalmente compreendida, três componentes principais estarão envolvidos no aparecimento da doença em pessoas susceptíveis: alterações na flora intestinal, na função de barreira do epitélio e uma resposta imunitária exacerbada. Esta resposta pode seguir um de dois caminhos: uma resposta TH1 exacerbada, que é mais associada à doença de Chron, ou uma resposta TH2 exacerbada, mais relacionada com a colite ulcerosa. A activação desta resposta e a libertação de citocinas correspondente está associada à inflamação crónica, envolvendo a síntese de mediadores de destruição tecidular como metaloproteases e espécies reactivas de oxigénio e nitrogénio, nomeadamente óxido nítrico. O factor de transcrição, factor nuclear kappa B (NF-κB) desempenha um papel fundamental na elaboração da resposta inflamatória através da regulação da expressão de muitos dos genes envolvidos nessa resposta, nomeadamente metaloproteases (Megías et al., 2007) e a isoforma indutível da sintetase do óxido nítrico (iNOS), que produz grandes quantidades de óxido nítrico (Aktan, 2004). Dado o papel central da inflamação na patogénese da DII e a função crucial do NF-κB nesse processo, este trabalho teve como principal objectivo o screening de um conjunto de óleos essenciais para actividade anti-inflamatória em células do epitélio intestinal. Com este fim, a linha celular de células humanas de adenocarcinoma colorectal, C2Bbe1, foi usada como modelo para investigar a capacidade de óleos essencias de inibir a activação do NF-κB e a expressão dos seus genes alvo, usando a iNOS como indicador, induzido por uma mistura de citocinas pró-inflamatórias, compostas de interferon-γ, factor de necrose tumoral-α e interleucina-1β. Para este estudo, quatro óleos essenciais, obtidos das plantas Thapsia villosa, Otanthus maritimus, Lavandula luisieri e Laserpitium elasii, foram seleccionados, baseando-se na sua composição, tal que, em conjunto, representam as principais famílias químicas encontrados em óleos essenciais. O óleo essencial de Annona muricata foi seleccionado dada a sua indicação etnofarmacológica como um agente antiinflamatório. Finalmente, α-pineno, o principal componente do óleo essencial obtido das folhas de Juniperus oxycedrus, foi também testado, uma vez que foi anteriormente dado como inibidor da activação de NF-κB e produção de óxido nítrico induzidas por IL-1, em condrócitos humanos (Neves et al., 2009). Os óleos essenciais que inibiram a expressão de iNOS foram então testados para a sua capacidade de reduzir a activação do NF-κB induzida pela mistura de citocinas, através da medição dos níveis citoplamáticos do seu inibidor, IκB-α, na forma total e fosforilada. De modo a avançar ainda mais o processo de identificação de compostos activos, depois de completa a fase de screening, o óleo essecial que exibiu a maior potência na inibição do NF-κB, foi fraccionado por cromatografia gasosa/espectrometria de massa e as fracções resultantes foram então testadas quanto à sua capacidade de inibir a expressão de iNOS induzida pela mistura de citocinas. Os resultados obtidos mostraram que o óleo essencial de Lavandula luisieri numa concentração de 0,02% (v/v) suscitou a maior inibição da expressão da iNOS induzida pela mix (16,8 ± 12%) e activação de NF-κB, medido pelos níveis do seu inibidor, IκB-α, na sua forma total e fosforilada (37 ± 11,5%). Para além disso, as fracções C e D do mesmo óleo foram eficazes na redução da expressão de iNOS, enquanto as fracções A e B não tiveram qualquer efeito. Ainda assim, a fracção C mostrou ser mais potente que a fracção D, uma vez que ambas as concentrações testadas reduziram a expressão de iNOS (78,8 ± 5,5% e 28,6 ± 14,2%, respectivamente), enquanto que apenas a concentração mais elevada da fracção D provocou uma diminuição significativa (50,3 ± 13,3%). Por outro lado, os resultados obtidos não suportaram, no modelo usado, uma acção anti-inflamatória para o óleo essencial de Annona muricata, embora tal acção possa também ocorrer por um mecanismo distinto da inibição de NF-κB. Tendo em conta todos os resultados obtidos, estes mostraram que o óleo essencial de Lavandula luisieri contém composto(s) capazes de inibir a activação de NF-κB e a expressão dos seus genes alvo nas células do epitélio intestinal humanas. No nosso conhecimento, este é o primeiro estudo que associa os óleos essenciais de Lavandula luisieri com actividade anti-inflamatória. Além disso, este estudo permitiu a identificação de duas fracções desse óleo que muito provavelmente contêm o(s) composto(s) responsáveis pela inibição da expressão da iNOS e da activação do NF- κB. Deste modo, o fraccionamento e screening adicionais são mandatários para a identificação do(s) composto(s) activo(s) e caracterização, em maior detalhe, do(s) mecanismo(s) correpondente(s), através dos quais exercem a sua actividade antiinflamatória. Estes estudos irão abrir caminho para optimizações químicas e farmacológicas dos compostos activos identificados podendo conduzir ao desenvolvimento de novas moléculas, esperançosamente mais eficazes para o tratamento de DII.

Inflammatory bowel disease (IBD) is a collective term for chronic inflammation of the gastrointestinal tract. The major forms of IBD are Ulcerative colitis (UC) and Chron’s disease (CD). Although the etiology of IBD is not fully understood, three major components are likely involved in susceptible hosts: altered intestinal flora and barrier function of the epithelium and exacerbated immune response. This response may follow one of two pathways: an exacerbated TH1 response that is more associated with CD or an exacerbated TH2 response that is more linked to UC. Activation of this response and corresponding cytokine release is associated with chronic inflammation, involving the generation of tissue destruction mediators, like matrix metalloproteinases (MMPs), and reactive oxygen (ROS) and nitrogen (RNS) species, namely nitric oxide (NO). The transcription factor, Nuclear Factor-kappaB (NF-κB), plays a key role in mounting the inflammatory response, by regulating the expression of many genes involved in that response, namely MMPs (Megías et al., 2007) and the inducible isoform of the NO Synthase (iNOS), which produces large amounts of NO (Aktan, 2004). Given the central role of inflammation in the pathogenesis of IBD and the crucial function of NF-kB in that process, this work aimed at screening a set of essential oils for anti-inflammatory properties towards intestinal epithelial cells. For this, the human colorectal adenocarcinoma cell line, C2Bbe1, was used as a model to investigate the ability of the essential oils to inhibit the activation of NF-κB and the expression of its target genes, using iNOS as an indicator, induced by a mixture of pro-inflammatory cytokines, composed of interferon-γ, tumour necrosis factor-α and interleukin-1β. For this study, four essential oils, obtained from Thapsia villosa, Otanthus maritimus, Lavandula luisieri and Laserpitium elasii, were selected, based on their composition, so that, taken together, they represented the major chemical families usually found in essential oils. The essential oil from Annona muricata was selected due to its etnopharmacological indication as an anti-inflammatory agent. Finally, α-pinene, the major component of the essential oil obtained from the leaves of Juniperus oxycedrus, was also screened, since it was previously found to inhibit IL-1-induced NF-κB activation and NO production in human chondrocytes (Neves et al., 2009). The essential oils found to inibit iNOS expression were then tested as to their ability to reduce the cytokine mixture-induced NF-kB activation by evaluating the cytoplasmic levels of total and phosphorylated forms of its inhibitor, IκB-α. To advance further the process of identification of active compounds, upon completion of the screening phase, the essential oil found to have the highest potency towards inhibition of NF-κB, was fractionated by Gas Chromatography/Mass Spectrometry and the resulting fractions were then screened for their ability to inhibit the cytokine mixtureinduced iNOS expression. The results obtained showed that the essential oil from Lavandula luisieri in a concentration of 0.02% (v/v) elicited the greatest inhibition of the mix-induced iNOS expression (16.8 ± 12%) and NF-κB activation, evaluated as the cytoplasmic levels of the total and phosphorylated (37 ± 11.5%) forms of its inhibitor, IκB-α. Moreover, fractions C and D of the same oil, were effective in reducing iNOS expression, while fractions A and B had no effect. Nonetheless, fraction C was found to be more potent than fraction D, since both concentrations tested reduced iNOS expression (78.8 ± 5.5% and 28.6 ± 14.2%, respectively), whereas only the highest concentration of fraction D elicited a significant decrease (50.3 ± 13.3%). On the other hand, the results obtained did not support, in the model used, an anti-inflammatory action for the essential oil of Annona muricata, although such an action can also occur through mechanisms other than the inhibition of NF-κB. Taken together, the results obtained show that the essential oil from Lavandula luisieri contains compound(s) capable of inhibiting NF-κB activation and the expression of its target genes in human intestinal epithelial cells. To our knowledge, this is the first study that associates the essential oil from Lavandula luisieri with anti-inflammatory activity. Moreover, this study allowed the identification of two fractions of that oil that likely contain the compound(s) responsible for inhibition of iNOS expression and NF-kB activation. Further fractionation and screening is, thus, mandatory to identify the active compound(s) and characterize in more detail the corresponding mechanism(s) of antiinflammatory action. These studies will pave the way for further chemical and pharmacological optimization of the active compounds identified and may ultimately lead to the development of novel and hopefully more effective molecules for the treatment of IBD.