Contribution of microglia to neural inflammation : neuropeptide y modulates interleukin-1ß-induced microglia activation

Abstract

Neuropeptide Y (NPY) holds consistent neuroprotective and proneurogenic properties in the Central Nervous System (CNS). In light of growing evidence supporting a role for NPY in the regulation of the immune system, we sought to investigate the effect of this neuropeptide over several aspects of microglial response to inflammation, namely, the production of inflammatory mediators, cell motility and phagocytosis. In chapter 1, we investigated the role of NPY in the modulation of LPS-induced release of inflammatory mediators, such as nitric oxide (NO) and interleukin-10 (IL-10). Upon lipopolysaccharide (LPS, 100 ng/ml) stimulation, we found that microglial cells increased the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS), as well as the production of NO, as quantified by Griess Assay. Moreover, microglial cells co-stimulated with LPS and adenosine triphosphate (ATP, 1 mM) responded with a massive release of IL-10, as measured by ELISA. We observed that LPS (100 ng/ml) and IL-10 (1.5 ng/ml) stimulation induced NO production, a response prevented in the presence of a selective IL-1 receptor antagonist (IL-1ra, 150 ng/ml). Furthermore, LPS-induced NO production mediated by IL-10 occurred through a nuclear factor-kappaB (NF-kB)-dependent pathway. We observed that NPY inhibited IL-10 release and downstream nuclear translocation of NF-kB (determined by confocal microscopy and Western blotting), which is implicated in iNOS expression and NO synthesis. Pharmacological studies with a selective Y1 receptor agonist ([Leu31,Pro34]NPY, 1 μM) and selective antagonists for receptors Y1 (BIBP3226, 1 μM), Y2 (BIIE0246, 1 μM) and Y5 (L-152,804, 1 μM) demonstrated that NPY inhibition was mediated exclusively through Y1 receptor activation. In chapter 2, we investigated the role of NPY in the modulation of IL-10-induced microglial motility and the signaling pathway involved in this process. Interestingly, co-stimulation of microglial cells with LPS (100 ng/ml) and ATP (1 mM) resulted in increased cell motility, an effect inhibited by IL-1ra (150 ng/ml), which strongly suggested the participation of IL-10 in this process. In our scratch wound assay, we also observed that IL-10-induced motility was prevented by SB239063 (20 μM), a selective inhibitor of p38 mitogenactivated protein kinase (MAPK). IL-10 (1.5 ng/ml) induced p38 MAPK phosphorylation, followed by nuclear translocation, and this effect was inhibited by NPY via Y1 receptor activation, as observed by confocal microscopy and Western blotting. Likewise, p38 MAPK inhibition decreased the extent of actin filament reorganization occurring during plasma membrane ruffling. Given that both LPS and IL-10 induced significant alteration to the cell cytoskeleton, we proceeded to investigate the role of NPY in the regulation of LPS-induced microglial cell phagocytosis, in chapter 3. Accordingly, we observed that LPS (100 ng/ml) increased latex bead phagocytosis by microglia. Consistently, co-administration of LPS (100 ng/ml) and ATP (1 mM) increased bead phagocytosis and this effect was blocked by IL-1ra (150 ng/ml), suggesting the involvement of IL-10. Moreover, direct application of IL-10 (1.5 ng/ml) augmented the number of phagocytosed beads, while NPY acting through Y1 receptor activation inhibited this effect. To conclude, we assigned a novel role for NPY in the regulation of important microglial responses to danger signals in the brain, involving the production and release of inflammatory mediators, cell motility and phagocytosis.

O neuropeptídeo Y (NPY) detém importantes propriedades neuroprotectoras e próneurogénicas no Sistema Nervoso Central (CNS). Dado o número crescente de evidências que sugerem um papel imuno-regulador para este neuropeptídeo, propusemo-nos estudar o efeito do NPY sobre vários aspectos da resposta da microglia à inflamação, nomeadamente, a produção de mediadores inflamatórios, motilidade celular e fagocitose. No capítulo 3, investigámos o papel do NPY na modulação da libertação de mediadores inflamatórios, tais como óxido nítrico (NO) e interleucina-10 (IL-10), após exposição a lipopolissacarídeo (LPS). Após estimulação com LPS (100 ng/ml), as células da microglia aumentaram a expressão da sintetase induzível do óxido nítrico (iNOS), assim como a produção de NO, quantificado com recurso ao ensaio de Griess. Adicionalmente, as células da microglia estimuladas com LPS e adenosina trifosfato (ATP, 1 mM) responderam com uma libertação massiva de IL-10, quantificado por ELISA. Observámos também que a exposição a IL-10 (1,5 ng/ml) induziu a produção de NO, uma resposta inibida na presença do antagonista selectivo para o receptor IL-1R (IL-1ra, 150 ng/ml). A produção de NO induzida por LPS é, assim, mediada por IL-10. Observámos que NPY inibiu a libertação de IL-10 e a translocação nuclear de NF-kB (determinada por microscopia confocal e por Western blotting), um processo implicado na expressão de iNOS e na síntese de NO. Uma abordagem farmacológica, recorrendo à utilização de um agonista para o receptor Y1 ([Leu31,Pro34]NPY, 1 μM), e de antagonistas para os receptores Y1 (BIBP3226, 1 μM), Y2 (BIIE0246, 1 μM) e Y5 (L-152,804, 1 μM) permitiu identificar o receptor Y1 como o principal responsável pelo efeito inibitório do NPY. No capítulo 4, investigámos o papel do NPY na modulação da motilidade da microglia induzida por IL-10, e a via de sinalização envolvida neste processo. A co-estimulação das células da microglia com LPS (100 ng/ml) e ATP (1 mM) resultou no aumento de motilidade celular, um processo inibido por IL-1ra (100 ng/ml), o que sugeriu o envolvimento de IL-10 neste processo. Com recurso a um ensaio de lesão, observámos que a motilidade induzida por IL-10 foi inibida por SB239063 (20 μM), um composto que inibe a activação da cinase p38. IL-10 (1,5 ng/ml) induziu a fosforilação da cinase p38, e a translocação da forma fosforilada para o núcleo. Este processo foi inibido por NPY através da activação do receptor Y1 (observado por microscopia confocal e Western blotting). Da mesma forma, a inibição da p38 diminui a reorganização dos filamentos de actina que ocorre durante o “ruffling” membranar, um processo que reflecte a expansão da membrana, durante a migração celular. No capítulo 5, investigámos o papel do NPY na regulação do processo fagocítico estimulado por LPS. Assim, observámos que LPS (100 ng/ml) aumentou o número de micro-esferas de látex fagocitadas por microglia. A co-administração de LPS (100 ng/ml) e ATP (1 mM) aumentou a fagocitose de micro-esferas de látex e este efeito foi bloqueado por IL-1ra (150 ng/ml), sugerindo o envolvimento de IL-10. A aplicação directa de IL-10 aumentou o número de micro-esferas fagocitadas, enquanto o NPY inibiu este efeito através da activação do receptor Y1. Em suma, atribuímos um novo papel ao NPY na regulação de respostas da microglia a sinais inflamatórios no cérebro, envolvendo a produção e libertação de mediadores inflamatórios, motilidade celular e fagocitose.