Análise não invasiva da acetil-CoA hepática por biópsia química

Abstract

Nas últimas décadas a incidência de resistência à insulina e de diabetes tipo 2 têm aumentado a nível mundial, principalmente devido a alterações nos estilos de vida e na dieta. As acções da insulina no metabolismo hepático são fundamentais para promover o armazenamento de glucose e de lípidos. A diabetes é caracterizada em parte por defeito e/ou insuficiência na acção da insulina hepática, que se reflectem em níveis anormais de glucose e de lípidos no sangue. O fígado desempenha um papel fundamental na regulação da homeostase corporal da glucose e dos lipídos e na forma como estes são utilizados na gestão energética. Como tal, alterações hepáticas do metabolismo da glucose e dos lípidos poderão ocupar um papel central no desenvolvimento de patologias como a diabetes mellitus. Em particular estas condições são caracterizadas por níveis elevados de triglicerídeos hepáticos. O aumento na síntese de TG no fígado, ou ―de novo lipogénese‖ (DNL) tem sido apontado como um factor que contribui para o aumento dos TG hepáticos, e por isso, há um grande interesse no desenvolvimento de métodos para caracterizar a DNL. A acetil-CoA hepática é um produto comum do metabolismo de muitos nutrientes, tais como hidratos de carbono, ácidos gordos e alguns aminoácidos, e é o substrato inicial para a DNL. O enriquecimento da acetil-CoA em 13C a partir de nutrientes específicos permite retirar informação acerca da sua contribuição para a DNL. O enriquecimento da acetil-CoA em 2H, obtido a partir da 2H2O, em relação ao dos triglicerídeos, informa relativamente à contribuição total da DNL para a formação de triglicerídeos hepáticos. Assim, a quantificação dos enriquecimentos em 2H e 13C da acetil-CoA fornece informações fundamentais relativamente às contribuições de diferentes metabolitos para a DNL, bem como acerca da contribuição total da DNL para os níveis de triglicerídeos hepáticos. A acetil-CoA está presente no organismo em concentrações micromolares, sendo difícil de isolar dos tecidos do fígado e, portanto, relativamente inacessível para análise do enriquecimento a partir de marcadores metabólicos. No entanto, considerando o papel do fígado na desintoxicação e depuração de moléculas não-naturais (xenobióticos), a acetil-CoA é utilizada como dador do grupo acetil para a acetilação destes compostos na etapa inicial de desintoxicação e remoção. O ácido paminobenzóico (PABA) é um xenobiótico que é rapidamente acetilado seguido de vii eliminação do produto ácido acetil p-aminobenzóico (N-Ac-PABA) na urina. Assim, o enriquecimento da acetil-CoA hepática pode ser determinado a partir da análise não invasiva do N-Ac-PABA presente na urina. Os principais objectivos deste trabalho foram desenvolver procedimentos de recolha e purificação do N-Ac-PABA em roedores, seguido do desenvolvimento da análise por espectroscopia de RMN de 2H e de 13C da porção acetil da molécula. A farmacocinética da eliminação do N-Ac-PABA na urina em ratos e ratinhos foi determinada a fim de optimizar a dosagem de PABA a ser administrada a cada uma das espécies e a desenvolver protocolos para determinação do enriquecimento da acetil- CoA durante diferentes estados nutricionais. Em estudos onde foi administrada 2H2O a roedores mantidos em jejum ou em condições normais de alimentação foram desenvolvidos métodos de RMN para quantificação do enriquecimento em 2H do grupo acetil do N-Ac-PABA. Pela análise do N-Ac-PABA eliminado na urina por 2H RMN demonstrou-se que o enriquecimento da acetil-CoA é aproximadamente igual ao da body water e que em diferentes estados nutricionais é constante. Em ratinhos foi demonstrada a equivalência entre o enriquecimento da acetil- CoA e da BW e, assim, verifica-se que o enriquecimento em 2H da BW pode utilizado como substituto para o da acetil-CoA hepática simplificando a análise da DNL com 2H2O. Para o desenvolvimento de métodos para a determinação da contribuição de vários substratos para formação de acetil-CoA hepática diferentes espécies de roedores foram injectadas com marcadores metabólicos de 13C na presença de PABA, e foi determinado o enriquecimento em 13C do N-Ac-PABA eliminado. Foi realizado em ratinhos um teste de tolerância à glucose, com [U-13C]glucose e o enriquecimento em 13C da acetil-CoA hepática foi determinado pela análise por 13C RMN do N-Ac-PABA eliminado em diferentes intervalos após injecção. Apesar de dose injectada de glucose ser relativamente alta a sua contribuição para a acetil-CoA formada nas condições do estudo foi surpreendentemente baixa (~2.0%). Este resultado pode estar relacionado com a fraca indução na via glicolítica hepática provocada por uma única dose de glucose em animais em jejum, porém os dados demonstram os limites de detecção e sensibilidade do método de 13C RMN, desde que seja recuperada uma quantidade suficiente de N-Ac-PABA na urina. Num estudo piloto final, administrando uma dose constituída por uma mistura de 50/5º de [U-13C]frutose e [1-13C]glucose foi possível determinar, ainda que baixos, o enriquecimento em 13C da acetil-CoA formada a partir viii dos diferentes substratos. Estes dados podem reflectir uma combinação da baixa indução enzimática da via glicolítica e uma depressão aguda nos níveis de ATP hepático pela fosforilação da frutose. Pode concluir-se, mesmo nesta fase inicial, que o estudo do enriquecimento da acetil-CoA hepática a partir de nutrientes específicos, como a glucose e a frutose, pode ser mais eficaz através na incorporação de marcadores metabólicose de 13C na comida dos animais durante um período prolongado, em vez de serem administrados numa dose individual