New insights into the biosynthesis of the Mycobacterial Methylglucose Lipopolysaccharide

Abstract

Mycobacterium tuberculosis owes much of its pathogenicity to a thick hydrophobic envelope, rich in complex fatty acids (mycolic acids), that protects the cells from the host’s defenses and modulates the immune response. Mycobacteria are known to synthesize cytoplasmic polymethylated polysaccharides (PMPS) that modulate fatty acid synthesis and act as their carriers to the cell wall assembly. Two PMPS were identified; the methylglucose lipopolysaccharide (MGLP) and the methylmannose polysaccharide (MMP). While MGLP is a complex, branched and acylated structure that contains glyceric acid at the reducing end, MMP is a linear polysaccharide that was never identified in pathogenic mycobacteria. We have identified two genes responsible for the synthesis of glucosylglycerate (GG), the putative primer for MGLP synthesis. One of the genes (Rv1208), was considered essential to the growth of M. tuberculosis and encodes a glucosyl-3-phosphoglycerate synthase (GpgS), belonging to the GT81 family of glycosyltransferases. This enzyme uses 3-phosphoglycerate and NDP-glucose to synthesize glucosyl-3-phosphoglycerate (GPG). The other (Rv2419c) encodes a glucosyl-3-phosphoglycerate phosphatase (GpgP) that promotes the dephosphorylation of GPG to GG. The mycobacterial GpgP, unlike all other known GpgPs that belong to the HAD-like hydrolase superfamily, belongs to the histidine phosphatase superfamily. Both genes are present in all mycobacteria with sequenced genome, including all species known to synthesize the MGLP and in other different actinobacteria. The two corresponding enzymes were produced in recombinant form, purified and characterized. Biochemical data revealed that both the enzymes were highly specific for their substrates. Recently, maltose-1-phosphate was demonstrated to be the intermediate in a pathway linking trehalose with the synthesis of glycogen and other α-glucans, including the MGLP and, if accumulated, it was also found to be toxic to M. tuberculosis. In this study, we also produced, purified and biochemically characterized the mycobacterial maltose-1-phosphate synthesizing enzyme (maltokinase). Although the M. tuberculosis H37Rv mak gene (Rv0127) was considered essential for growth, no mycobacterial maltokinase had been characterized, to date. Unlike other maltokinases studied to date, the mycobacterial enzyme showed high specificity towards the maltose acceptor but high flexibility for the phosphate donors, namely ATP, GTP and UTP. Although it was previously demonstrated that the maltokinase is involved in the conversion of trehalose into α-glucans, the proposed essentiality of this enzyme together with the non essentiality of the pathway points to other, yet unexplored roles of maltose-1-phosphate in mycobacterial physiology. The proposed essentiality of the gpgS gene and of other genes putatively involved in MGLP synthesis in M. tuberculosis, points to a vital role of this polysaccharide in this organism; however, this remains to be experimentally established. This thesis unravels the identity of two of the genes and enzymes involved in the pathway leading to MGLP synthesis and furthers our understanding on how this important mycobacterial structure is synthesized, paving the way to future studies on the function of MGLP in mycobacterial physiology.

Mycobacterium tuberculosis deve grande parte da sua patogenicidade a uma parede espessa e hidrofóbica rica em ácidos gordos complexos (ácidos micólicos) que a protege das defesas do hospedeiro e que altera a resposta imunológica do hospedeiro. As micobactérias sintetizam polissacarídeos polimetilados citoplasmáticos que regulam a síntese de ácidos gordos e actuam como transportadores destes para a síntese da parede celular. Dois polissacarídeos polimetilados foram identificados nestes organismos: o lipopolissacarídeo de metil glicose (MGLP) e o polissacarídeo de metil manose (MMP). Enquanto o primeiro é uma estrutura complexa, ramificada e acilada que contem ácido glicérico no terminal redutor o segundo é uma estrutura linear que nunca foi identificada em micobacterias patogénicas. Neste trabalho foram identificados dois genes, responsáveis pela síntese de glicosilglicerato (GG), que é a o iniciador proposto para a via biosintética do MGLP. Um dos genes (Rv1208) foi considerado essencial para o crescimento de M. tuberculosis e codifica uma glicosil-3-fosfoglicerato sintetase (GpgS), que pertence à família GT81 das glicosiltransferases e que usa 3-fosfoglicerato e NDP-glicose para sintetizar glicosil-3-fosfoglicerato (GPG). O segundo gene, (Rv2419c), codifica uma glicosil-3-fosfoglicerato fosfatase (GpgP), que catalisa a desfosforilação do GPG a GG. A GpgP de micobacterias, ao contrário de todas as outras GpgPs encontradas até agora, que pertencem à superfamília das hidrolases semelhantes a dehalogenases haloácidas, pertence à superfamília das fosfatases com histidina. Ambos os genes estão presentes em todas as micobactérias com genoma sequenciado, em todas as espécies que sintetizam MGLP e em muitas outras actinobactérias. As duas enzimas correspondentes foram produzidas na forma recombinante, purificadas e caracterizadas. Os dados bioquímicos obtidos revelaram que ambas são extremamente específicas. Recentemente foi demonstrado em M. tuberculosis que a maltose-1-fosfato é um intermediário que liga a trealose com a síntese de glicogénio e outros α-glucanos, incluindo o MGLP e também notado que esta molécula é letal para as micobactérias se acumulada. Neste trabalho também se produziu, purificou e caracterizou a enzima micobacteriana que sintetiza maltose-1-fosfato (maltocinase). Apesar do gene que codifica esta enzima ter sido considerado essencial para M. tuberculosis nenhuma maltocinase tinha sido caracterizada até agora. Ao contrário de todas as outras maltocinases estudadas, a maltocinase micobacteriana mostrou ser bastante específica para a maltose e muito flexível, ao nível do dador de fosfato, nomeadamente para ATP, GTP e UTP. Apesar de ter sido demonstrado previamente que a maltocinase está envolvida na conversão de trealose a α-glucanos, a essencialidade desta enzima juntamente com a não essencialidade desta via metabólica indica outras funções ainda não conhecidas da maltose-1-fosfato na fisiologia micobacteriana. A essencialidade do gene que codifica a GpgS e de outros genes provavelmente envolvidos na síntese do MGLP em M. tuberculosis, indica uma função possivelmente vital deste polissacarídeo neste organismo, mas que no entanto ainda carece confirmação experimental. Esta tese revela a identidade de dois genes e enzimas envolvidos na via metabólica de síntese do MGLP e aumenta o conhecimento sobre a síntese deste importante polissacarídeo, abrindo o caminho para estudos futuros sobre a função desta estrutura na fisiologia micobacteriana.