Cytogenetic characterization of small supernumerary marker chromosomes : towards a genotype-phenotype correlation

Abstract

Cromossomas marcadores supranumerários sSMCs, do inglês, small Supernumerary Marker Chromosomes) são pequenos cromossomas estruturalmente anormais que aparecem adicionalmente aos 46 cromossomas humanos e que não podem ser identificados ou caracterizados por citogenética convencional, tendo um tamanho inferior a um cromossoma 20 da mesma placa metafásica. Os sSMCs constituem um grupo heterógeneo de cromossomas anómalos que podem ter diferentes formas, como cromossomas duplicados invertidos (inv dup), cromossomas minute cêntricos (min) e cromossomas em anel (r). O risco de alterações fenotípicas associadas à presença de um sSMC depende de vários factores, como a hereditariedade, a origem do cromossoma, a morfologia, o conteúdo genético, a presença de dissomia uniparental ou o grau de mosaicismo. De facto, os fenótipos associados a um sSMC são variáveis, desde normais a severamente afectados. Os sSMCs podem ser detectados em diagnóstico pós-natal ou em pré-natal constituindo, sobretudo no último caso, um problema complexo para a investigação citogenética e o aconselhamento genético. Tendo em conta dados publicados na literatura que estimam uma frequência de 0.044% recém-nascidos portadores de um sSMC e que a população mundial é estimada actualmente em cerca de 6 823 000 000 pessoas, pode-se extrapolar o número de aproximadamente 3 milhões de indíviduos no mundo portadores de um sSMC. A grande maioria destes indíviduos não tem manifestações fenotípicas aparentes, no entanto cerca de 26% dos casos de indivíduos com um sSMC terão manifestações fenotípicas que poderão ser mais ou menos severas. A maioria dos cromossomas marcadores publicados na literatura não têm uma caracterização citogenética detalhada, quer da origem quer do conteúdo genético, que permita uma correlação robusta com o fenótipo esperado. Este facto dificulta o aconselhamento genético quando é encontrado um sSMC, sobretudo em diagnóstico pré-natal. Neste domínio é essencial sistematizar o conhecimento sobre o conteúdo genético envolvido nos sSMC e a descriminação das manifestações fenotípicas expectáveis de um indivíduo ou grupo de indivíduos, sejam elas normais ou anormais. Com este trabalho pretendeu-se contribuir para esta sistematização, procedendo-se à caracterização por citogenética molecular de um grupo de cromossomas marcadores supranumerários derivados de vários cromossomas, nomeadamente dos cromossomas 1, 2, 5, 11, 13, 15, 16, 17, 18 e 22. Pretendeu-se validar a técnica de hibridização Genómica Comparativa por array (array CGH, do inglês array Comparative Genomic Hybrydization) para caracterização da extensão genética do cromossoma marcador, após a sua microdissecção e amplificação. Concluiu-se que esta técnica será de grande utilidade para a correcta caracterização de sSMCs sobretudo quando o cromossoma marcador está presente em mosaico de baixa expressão. Após caracterização molecular do grupo de sSMC em estudo estabeleceu-se, na medida do possível, uma relação genótipo/fenótipo, comparando cada caso com outros casos reportados na literatura. Neste trabalho propõem-se ainda linhas de orientação para lidar com casos de sSMC num laboratório de diagnóstico em citogenética, tendo em consideração factores como por exemplo o tempo para a caracterização citogenética, o grau de mosaicismo e as técnicas disponíveis no laboratório. O trabalho incluído nesta dissertação reforça e clarifica a necessidade de uma caracterização citogenética molecular detalhada de cromossomas marcadores supranumerários, recorrendo nomeadamente a técnicas de M-FISH e de array CGH. Esta caracterização possibilita o estabelecimento de relações genótipo/fenótipo cada vez mais precisas e essenciais para um correcto aconselhamento genético, por parte do Geneticista Clínico.

Small supernumerary marker chromosomes (sSMCs) are small structurally abnormal chromosomes that occur in addition to the 46 human chromosomes, that cannot be identified or characterized unambiguously by conventional banding cytogenetics alone, and are (in general) equal in size or smaller than a chromosome 20 of the same metaphase spread. sSMCs are a morphologically heterogeneous group of structural abnormal chromosomes that can appear in different shapes: inverted duplicated chromosomes (inv dup), centric minute chromosomes (min) and ring chromosomes (r). The risk for phenotypic abnormalities associated with a sSMC depends on several factors, including nheritance, chromosomal origin, morphology, genetic content, presence of uniparental disomy or grade of mosaicism. In fact, phenotypes associated with a sSMC are variable, from normal to severely affected. sSMCs can be detected postnatally or prenatally, the last being a major problem for cytogenetic investigation and genetic counselling. Taking into account data in the literature that estimate a 0.044% frequency of newborns with a sSMC and that the estimated world population is 6 823 000 000 people, there will be at present approximately 3 million living sSMC carriers. The great majority of these carriers will not have apparent phenotypical consequences. However, about 26% of individuals with a sSMC will have phenotypical manifestations, more or less severe. The majority of sSMCs published in the literature do not have an accurate cytogenetics characterization, of the origin and genetic content of the marker, which allows a robust correlation with the expected phenotype. This is a difficulty for genetic counselling when a sSMC is encountered, especially at prenatal diagnosis. It is essential to systematize the knowledge of the genetic content of markers and the phenotypical manifestations encountered, normal or abnormal. With this work we want to contribute to this systematization, by doing a detailed molecular cytogenetic characterization of a group of sSMC derived from different chromosomes, namely chromosomes 1, 2, 5, 11, 13, 15, 16, 17, 18 and 22. We aimed to validate array CGH technique, after the microdissection and amplification of the marker, for the characterization of the genetic extension of the sSMC. We concluded that this technique is of great value for an accurate characterization of the marker, especially when the sSMC is present in low levels of mosaicism. After the characterization of the group of sSMCs cases in study, it was established a genotype/phenotype correlation, whenever possible, and a comparison of each case with those described in the literature was done. In this work, guidelines are proposed for the management of sSMCs in a diagnostic cytogenetic laboratory, taking into account several factors, like time available for the cytogenetic characterization, levels of mosaicism and techniques availability in the lab. This work reinforces and clarifies the need of an accurate molecular cytogenetic characterization of sSMCs, using particularly M- FISH techniques or array CGH. This characterization allows the establishment of more precise enotype/phenotype correlations, which are essential for an accurate genetic counselling by the Clinic Geneticist.